Orchestrated action of peptidoglycan (PG) synthetases and hydrolases is vital for bacterial growth and viability. Although the function of several PG synthetases e.g., penicillin binding proteins is well-understood, the function, regulation, and mechanism of action of the majority of PG hydrolases have remained elusive. Lysostaphin-like zinc-dependent metalloendopeptidases specifically hydrolyse the glycyl-glycine peptide bond in the notorious pathogen Staphylococcus aureus. In this work, we have employed NMR spectroscopy to study the substrate specificity of the well-established bactericide lysostaphin as well as pre-designated S. aureus autolysin LytM. Our results show that the substrate specificities of these highly homologous enzymes are divergent and formerly also inaccurately defined. Yet, we provide substrate-level evidence for the functional role of these enzymes. Indeed, we show that LytM and anti-staphylococcal bactericidin lysostaphin target the D-Ala-Gly cross-linked part of mature peptidoglycan.

The widely used molecular evolutionary clock assumes the divergent evolution of proteins. Convergent evolution has been proposed only for small protein elements but not for an entire protein fold. We investigated the structural basis of the protein splicing mechanism by class 3 inteins, which is distinct from class 1 and 2 inteins. We gathered structural and mechanistic evidence supporting the notion that the Hedgehog/INTein (HINT) superfamily fold, commonly found in protein splicing and related phenomena, could be an example of convergent evolution of an entire protein fold. We propose that the HINT fold is a structural and biochemical solution for trans-peptidyl and trans-esterification reactions.