Summary Protein-protein interactions play an important biological role in every aspect of cellular homeostasis and functioning. Proximity labeling mass spectrometry-based proteomics overcomes challenges typically associated with other methods, and has quickly become the current state-of-the-art in the field. Nevertheless, tight control of proximity labeling enzymatic activity and expression levels is crucial to accurately identify protein interactors. Here, we leverage a T2A self-cleaving peptide and a non-cleaving mutant to accommodate the protein-of-interest in the experimental and control TurboID setup. To allow easy and streamlined plasmid assembly, we built a Golden Gate modular cloning system to generate plasmids for transient expression and stable integration. To highlight our T2A Split-link design, we applied it to identify protein interactions of the glucocorticoid receptor and SARS-CoV-2 nucleocapsid and NSP7 proteins by TurboID proximity labeling. Our results demonstrate that our T2A split-link provides an opportune control that builds upon previously established control requirements in the field. Motivation In proximity labeling proteomics protein-protein interactions are identified by in vivo biotinylation. However, the current lack of a universally applicable negative control for differential analysis affects accurate mapping of the interactome. To bridge this gap, we conceptualized a system based on the T2A self-cleaving peptide to match expression levels between control and bait protein setups while using the same bait protein. In addition, we implemented a versatile modular cloning system to build mammalian expression vectors for, but not limited to, proximity labeling assays.

Extracellular vesicles (EVs), membrane-delimited nanovesicles that are secreted by cells into the extracellular environment, are gaining substantial interest due to their involvement in cellular homeostasis and their contribution to disease pathology. The latter in particular has led to an exponential increase in interest in EVs as they are considered to be circulating packages containing potential biomarkers and are also a possible biological means to deliver drugs in a cell-specific manner. However, several challenges hamper straightforward proteome analysis of EVs as they are generally low abundant and reside in complex biological matrices. These matrices typically contain abundant protein concentrations that vastly exceed those of the EV proteome. Therefore, extensive EV isolation and purification protocols are imperative and many have been developed, including (density) ultracentrifugation, size-exclusion and precipitation methods. Here, we describe filter-aided extracellular vesicle enrichment (FAEVEr) as an approach based on 300 kDa MWCO filtration that allows the processing of multiple samples in parallel within a reasonable timeframe and at moderate cost. We demonstrate that FAEVEr is capable of quantitatively retaining EV particles on filters, whilst allowing extensive washing with the mild detergent TWEEN-20 to remove interfering non-EV proteins. The retained particles are directly lysed on the filter for a complete recovery of the EV protein cargo towards proteome analysis. Here, we validate and optimize FAEVEr on recombinant EV material and apply it on conditioned medium as well as on complex serum. Our results indicate that EVs isolated from MCF7 cells cultured with or without serum have a drastic different proteome because of nutrient deprivation.

Abstract Alternative translation initiation and alternative splicing may give rise to N-terminal proteoforms, proteins that differ at their N-terminus compared to their canonical counterparts. Such proteoforms can have altered localizations, stabilities and functions. While proteoforms generated from splice variants can be engaged in different protein complexes, it remained to be studied to what extent this applies to N-terminal proteoforms. To address this, we mapped the interactomes of several pairs of N-terminal proteoforms and their canonical counterparts. First, we generated a catalogue of N-terminal proteoforms found in the HEK293T cellular cytosol from which 22 pairs were selected for interactome profiling. Additionally, we provide evidence for the expression of several N-terminal proteoforms, identified in our catalogue, across different human tissues as well as tissue-specific expression, highlighting their biological relevance. Protein-protein interaction profiling revealed that the overlap of the interactomes for both proteoforms is generally high, showing their functional relation. We also showed that N-terminal proteoforms can be engaged in new interactions and/or lose several interactions compared to their canonical counterpart, thus further expanding the functional diversity of proteomes.

Abstract Ribosome profiling has revealed translation outside of canonical coding sequences (CDSs) including translation of short upstream ORFs, long non-coding RNAs, overlapping ORFs, ORFs in UTRs or ORFs in alternative reading frames. Studies combining mass spectrometry, ribosome profiling and CRISPR-based screens showed that hundreds of ORFs derived from non-coding transcripts produce (micro)proteins, while other studies failed to find evidence for such types of non-canonical translation products. Here, we attempted to discover translation products from non-coding regions by strongly reducing the complexity of the sample prior to mass spectrometric analysis. We used an extended database as the search space and applied stringent filtering of the identified peptides to find evidence for novel translation events. Theoretically, we show that our strategy facilitates the detection of translation events of transcripts from non-coding regions, but experimentally only find 19 peptides (less than 1% of all identified peptides) that might originate from such translation events. Virotrap based interactome analysis of two N-terminal proteoforms originating from non-coding regions finally showed the functional potential of these novel proteins.