Bed nucleus of the stria terminalis (BNST) neurons that synthesize and release the stress neuropeptide corticotropin-releasing factor (CRF) drive binge alcohol drinking and anxiety, behaviors that are primary risk factors for alcohol use disorder (AUD) and comorbid neuropsychiatric diseases more common in women than men. Here, we show that female C57BL/6J mice binge drink more than males and have greater basal BNST CRF neuron excitability and synaptic excitation. We identified a dense VGLUT2+ glutamatergic synaptic input from the paraventricular thalamus (PVT) that is anatomically similar in males and females. These PVT BNST neurons release glutamate directly onto BNST CRF neurons but also engage a large BNST interneuron population to ultimately provide a net inhibition of BNST CRF neurons, and both components of this polysynaptic PVT VGLUT2 -BNST CRF circuit are more robust in females than males. Chemogenetic inhibition of the PVT BNST projection promoted binge alcohol drinking in females without affecting males, and chemogenetic activation of the pathway was sufficient to reduce avoidance behavior in both sexes in anxiogenic contexts. Lastly, we show that withdrawal from repeated binge drinking produces a female-like phenotype in the male PVT-BNST CRF excitatory synapse without altering the function of PVT BNST neurons per se . Our data describe a complex feedforward inhibitory PVT VGLUT2 -BNST CRF glutamatergic circuit that is more robust in females, plays sex-dependent roles in alcohol drinking and avoidance behavior, and undergoes sex-dependent alcohol-induced plasticity.

Abstract Chronic stress during the developmental period of adolescence increases susceptibility to many neuropsychiatric diseases in adulthood, including anxiety, affective, and alcohol/substance use disorders. Preclinical rodent models of adolescent stress have produced varying results that are species, strain, sex, and laboratory-dependent. However, adolescent social isolation is a potent stressor in humans that has been reliably modeled in male rats, increasing adult anxiety-like and alcohol drinking behaviors, among others. In this study, we examined the generalizability and sex-dependence of this model in C57BL/6J mice, the most commonly used rodent strain in neuroscience research. We also performed a parallel study using social isolation in adulthood to understand the impact of adult social isolation on basal behavioral phenotypes. We found that six weeks of social isolation in adolescence beginning at postnatal day (PD) 28 produced a hypersocial phenotype in both male and female adults in multiple assays and a female-specific anxiolytic phenotype in the elevated plus maze, but it had no effects in other assays for avoidance behavior, fear conditioning, alcohol drinking, reward or aversion sensitivity, novel object exploration, or forced swim behavior in either sex. In contrast, social isolation in adulthood beginning at PD77 produced an anxiogenic phenotype in the light/dark box but had no effects on any other assays. Altogether, our results suggest that 1) adolescence is a critical period for social stress in C57BL/6J mice, producing aberrant social behavior in a sex-independent manner and 2) chronic individual housing in adulthood does not alter basal behavioral phenotypes that may confound interpretation of behavior following other laboratory manipulations.

The anterior and posterior subregions of the paraventricular thalamus (aPVT and pPVT, respectively) play unique roles in learned behaviors, from fear conditioning to alcohol/drug intake, potentially through differentially organized projections to limbic brain regions including the nucleus accumbens medial shell (mNAcSh). Here, we found that the aPVT projects broadly to the mNAcSh and that the aPVT-mNAcSh circuit encodes positive valence, such that in vivo manipulations of the circuit modulated both innately programmed and learned behavioral responses to positively and negatively valenced stimuli, particularly in females. Further, the endogenous activity of aPVT presynaptic terminals in the mNAcSh was greater in response to positively than negatively valenced stimuli, and the probability of synaptic glutamate release from aPVT neurons in the mNAcSh was higher in females than males. In contrast, we found that the pPVT-mNAcSh circuit encodes stimulus salience regardless of valence. While pPVT-mNAcSh circuit inhibition suppressed behavioral responses in both sexes, circuit activation increased behavioral responses to stimuli only in males. Our results point to circuit-specific stimulus feature encoding by parallel PVT-mNAcSh circuits that have sex-dependent biases in organization and function.

Episodic memories are stored in distributed neurons but how eligibility of individual neurons to coding ensembles is determined remains elusive. We identified thousands of predominantly bistable (CpG methylated or unmethylated) regions within neuronal gene bodies, established during the development of the mouse hippocampal dentate gyrus. Reducing DNA methylation and the proportion of the methylated epialleles at bistable regions compromised novel context-induced neuronal activation and spatial memory. Conversely, increasing methylation and the frequency of the methylated epialleles at bistable regions enhanced intrinsic excitability and spatial memory but impaired spatial working memory, indicating that the developmentally established methylated-unmethylated epiallelic balance at bistable regions is essential for proper neuronal excitability and hippocampal cognitive functions. Single-nucleus profiling revealed the enrichment of specific epialleles from a subset of bistable regions, primarily exonic, in encoding neurons. We propose a model in which epigenetically bistable regions create neuron heterogeneity, and specific constellations of exonic epialleles dictate, via modulating neuronal excitability, eligibility to a coding ensemble.

Background: Binge alcohol drinking is a risk factor linked to numerous disease states including alcohol use disorder (AUD). While men binge drink more alcohol than women, this demographic gap is quickly shrinking, and preclinical studies demonstrate that females consistently consume more alcohol than males. Further, women are at increased risk for the co-expression of AUD with neuropsychiatric diseases such as anxiety and mood disorders. However, little is understood about chronic voluntary alcohol drinking and its long-term effects on behavior. Here, we sought to characterize sex differences in chronic binge drinking and the effects of protracted alcohol abstinence on anxiety- and affective-related behaviors in males and females. Methods: We assessed binge alcohol drinking patterns in male and female C57BL/6J mice using a modified Drinking in the Dark (DID) paradigm in which mice received home cage access to one bottle of 10% or 20% alcohol (EtOH) or water for 2 hrs per day on Days 1-3 and to two bottles (EtOH/H2O + H2O) for 24 hrs on Day 4 for eight weekly cycles. Mice were then tested for the effects of protracted abstinence on avoidance, affective, and compulsive behaviors. Results: Female mice consumed more alcohol than males consistently across cycles of DID and at 2, 4, and 24-hr timepoints within the day, with a more robust sex difference for 20% than 10% EtOH. Females also consumed more water than males, an effect that emerged at the later time points; this water consumption bias diminished when alcohol was available. Further, while increased alcohol consumption was correlated with decreased water consumption in males, there was no relationship between these two measures in females. Alcohol preference was higher in 10% vs. 20% EtOH for both sexes. During protracted abstinence following chronic binge drinking, mice displayed decreased avoidance behavior (elevated plus maze, open field, novelty suppressed feeding) and increased compulsive behavior (marble burying) that was especially robust in females. There was no effect of alcohol history on stress coping and negative affective behaviors (sucrose preference, forced swim test, tail suspension) in either sex. Conclusion: Female mice engaged in higher volume binge drinking than their male counterparts. Although females also consumed more water than males, their higher alcohol consumption was not driven by increased total fluid intake. Further, the effects of protracted abstinence following chronic binge drinking was driven by behavioral disinhibition that was more pronounced in females. Given the reciprocal relationship between risk-taking and alcohol use in neuropsychiatric disease states, these results have implications for sex-dependent alcohol drinking patterns and their long-term negative neuropsychiatric/physiological health outcomes in humans.

The limitations of classical, soluble drugs in terms of subtype-specificity, spatiotemporal precision, and genetic targeting have spurred the development of advanced pharmacological techniques, including the use of covalently-tethered photoswitchable ligands. However, a major shortcoming of tethered photopharmacology is the inability to obtain optical control with a comparable efficacy to the native ligand. To overcome the limitations of photoisomerization efficiency and tethered ligand affinity, we have developed a family of branched photoswitchable compounds to target G protein-coupled metabotropic glutamate receptors (mGluRs). These compounds permit photo-agonism of Gi/o-coupled group II mGluRs with near-complete efficiency relative to saturating glutamate when attached to receptors via a range of orthogonal, multiplexable modalities including SNAP-, CLIP-, and Halo-tags, as well as via receptor-targeting nanobodies. Through a chimeric approach, branched ligands also allow efficient optical control of Gq-coupled mGluR5 with precise, dynamic subcellular targeting. Finally, branched ligands enabled the development of dual photoswitch-fluorophore compounds that allow simultaneous imaging and manipulation of receptors via the same attachment point. Together this work provides a new design framework for photoswitchable ligands and demonstrates a toolset suitable for quantitative, mechanistic study of neuromodulatory receptors at the molecular, cellular and circuit levels.

The overconsumption of alcohol contributes to a multitude of negative health outcomes, especially in women, who are more susceptible to its effects and more likely to develop alcohol dependence than men with the same early history of alcohol consumption. Binge alcohol drinking is prominent during reproductive years and correlated with high circulating estrogen in women, and rodent studies show that female rodents with intact ovaries consume more alcohol than males. However, the causal role of ovarian E2 in intact animals in alcohol drinking has not been established. Here, we show that intact female mice consume more alcohol and display reduced avoidance behavior when they have elevated levels of circulating E2 during proestrus compared to other estrous cycle stages in individual mice. We found that high ovarian E2 promotes alcohol drinking in females, but not anxiolysis, through rapid nongenomic E2 signaling at ERα in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute administration of intra-BNST E2 in low ovarian E2 mice enhanced binge alcohol intake, while acute systemic inhibition of E2 synthesis and acute blockade of ERα signaling in the BNST reversed the pro-drinking effects of high ovarian E2 status. In contrast, acute E2 manipulations were unable to alter the effects of ovarian E2 status on avoidance behavior, suggesting genomic mechanisms are required for the anxiolytic effects of ovarian E2. We further show that corticotropin-releasing factor (CRF) neurons in the BNST are an important mediator of these effects of rapid E2 signaling, as high E2 rapidly enhanced synaptic excitation of BNSTCRF neurons and promoted their pro-alcohol drinking behavioral role. Thus, we uncover a mechanism by which ovarian hormones in intact female mice control alcohol drinking behavior, and we provide the first mechanism by which ovarian E2 control of behavior is mediated by a rapid, nongenomic signaling mechanism.