Abstract Upper Mesopotamia played a key role in the Neolithic Transition in Southwest Asia through marked innovations in symbolism, technology, and foodways. We present thirteen ancient genomes (c.8500-7500 calBCE) from Pre-Pottery Neolithic Çayönü in the Tigris basin together with bioarchaeological and material culture data. Our findings reveal that Çayönü was a genetically diverse population, carrying a mixed ancestry from western and eastern Fertile Crescent, and that the community received immigrants. Our results further suggest that the community was organised along biological family lines. We document bodily interventions such as head-shaping and cauterization among the individuals examined, reflecting Çayönü’s cultural ingenuity. Finally, we identify Upper Mesopotamia as the likely source of eastern gene flow into Neolithic Anatolia, in line with material culture evidence. We hypothesise that Upper Mesopotamia’s cultural dynamism during the Neolithic Transition was the product not only of its fertile lands but also of its interregional demographic connections.

The testis displays striking anatomical divergence among primates. Multi-male species, such as chimpanzees, have recurrently evolved large testicles relative to single-male species, such as humans. However, the developmental mechanisms behind testis divergence and whether they involve convergent molecular changes, have remained unknown. Through comparative analysis of transcriptomic data, we show that a species’ testis expression profile, like testis size, can be a reliable indicator of mating type among primates, and possibly murids. Differential expression, in turn, largely reflects changes in the relative proportions of somatic/pre-meiotic versus meiotic/post-meiotic cell types. By studying mouse and macaque testis development, we find that single-male species’ testis expression profiles are paedomorphic relative to multi-male species’ profiles. For instance, human and gorilla testis profiles resemble those of adolescent mice. Our results suggest that heterochronic shifts involving conserved transcription regulators have been repeatedly employed in primate evolution, leading to rapid, convergent changes in testis size and histology.

There is growing interest in uncovering genetic kinship patterns in past societies using low-coverage paleogenomes. Here, we benchmark four tools for kinship estimation with such data: lcMLkin, NgsRelate, KIN, and READ, which differ in their input, IBD-estimation methods and statistical approaches. We used pedigree and ancient genome sequence simulations to evaluate these tools when only a limited number (1K to 50K) of shared SNPs (with minor allele frequency ≥0.01) are available. The performance of all four tools was comparable using ≥20K SNPs. We found that first-degree related pairs can be accurately classified even with 1K SNPs, with 85% F1 scores using READ and 96% using NgsRelate or lcMLkin. Distinguishing third-degree relatives from unrelated pairs or second-degree relatives was also possible with high accuracy (F1 >90%) with 5K SNPs using NgsRelate and lcMLkin, while READ and KIN showed lower success (69% and 79%, respectively). Meanwhile, noise in population allele frequencies and inbreeding (first cousin mating) led to deviations in kinship coefficients, with different sensitivities across tools. We conclude that using multiple tools in parallel might be an effective approach to achieve robust estimates on ultra-low coverage genomes.

Ancient DNA analysis is subject to various technical challenges, including bias towards the reference allele ("reference bias"), postmortem damage (PMD) that confounds real variants, and limited coverage. Here, we conduct a systematic comparison of alternative approaches against reference bias and against PMD. To reduce reference bias, we either (a) mask variable sites before alignment or (b) align the data to a graph genome representing all variable sites. Compared to alignment to the linear reference genome, both masking and graph alignment effectively remove allelic bias when using simulated or real ancient human genome data, but only if sequencing data is available in FASTQ or unfiltered BAM format. Reference bias remains indelible in quality-filtered BAM files and in 1240K-capture data. We next study three approaches to overcome postmortem damage: (a) trimming, (b) rescaling base qualities, and (c) a new algorithm we present here, bamRefine, which masks only PMD-vulnerable polymorphic sites. We find that bamRefine is optimal in increasing the number of genotyped loci up to 20% compared to trimming and in improving accuracy compared to rescaling. We propose graph alignment coupled with bamRefine to minimise data loss and bias. We also urge the paleogenomics community to publish FASTQ files.

Abstract We present paleogenomes of three morphologically-unidentified Anatolian equids dating to the 1 st millennium BCE, sequenced to coverages of 0.6-6.4X. Mitochondrial DNA haplotypes of the Anatolian individuals clustered with those of Equus hydruntinus (or Equus hemionus hydruntinus ), the extinct European wild ass. The Anatolian wild ass whole genome profiles fall outside the genomic diversity of other extant and past Asiatic wild ass ( E.hemionus ) lineages. These observations strongly suggest that the three Anatolian wild asses represent E.hydruntinus , making them the latest recorded survivors of this lineage, about a millennium later than the latest observations in the zooarchaeological record. Comparative genomic analyses suggest that E.hydruntinus was a sister clade to all ancient and present-day E.hemionus lineages, representing an early split. We also find indication of gene flow between hydruntines and Middle Eastern wild asses. Analyses of genome-wide heterozygosity and runs of homozygosity reveal that the Anatolian wild ass population had severely lost genetic diversity by the mid-1 st millennium BCE, a likely omen of its eventual demise.

Abstract A major challenge in zooarchaeology is to morphologically distinguish closely related species’ remains, especially using small bone fragments. Shotgun sequencing aDNA from archeological remains and comparative alignment to the candidate species’ reference genomes will only apply when reference nuclear genomes of comparable quality are available, and may still fail when coverages are low. Here, we propose an alternative method, MTaxi, that uses highly accessible mitochondrial DNA (mtDNA) to distinguish between pairs of closely related species from ancient DNA sequences. MTaxi utilises mtDNA transversion-type substitutions between pairs of candidate species, assigns reads to either species, and performs a binomial test to determine the sample taxon. We tested MTaxi on sheep/goat and horse/donkey data, between which zooarchaeological classification can be challenging in ways that epitomise our case. The method performed efficiently on simulated ancient genomes down to 0.5x mitochondrial coverage for both sheep/goat and horse/donkey, with no false positives. Trials on n=18 ancient sheep/goat samples and n=10 horse/donkey samples of known species identity with mtDNA coverages 0.1x - 12x also yielded 100% accuracy. Overall, MTaxi provides a straightforward approach to classify closely related species that are compelling to distinguish through zooarchaeological methods using low coverage aDNA data, especially when similar quality reference genomes are unavailable. MTaxi is freely available at https://github.com/goztag/MTaxi .

Sheep was among the first domesticated animals, but its demographic history is little understood. Here we present combined analyses of mitochondrial and nuclear polymorphism data from ancient central and west Anatolian sheep dating to the Late Glacial and early Holocene. We observe loss of mitochondrial haplotype diversity around 7500 BCE during the early Neolithic, consistent with a domestication-related bottleneck. Post-7000 BCE, mitochondrial haplogroup diversity increases, compatible with admixture from other domestication centres and/or from wild populations. Analysing archaeogenomic data, we further find that Anatolian Neolithic sheep (ANS) are genetically closest to present-day European breeds, and especially those from central and north Europe. Our results indicate that Asian contribution to south European breeds in the post-Neolithic era, possibly during the Bronze Age, may explain this pattern.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.