The crystal structure of the bacterial 70 S ribosome refined to 2.8 angstrom resolution reveals atomic details of its interactions with messenger RNA (mRNA) and transfer RNA (tRNA). A metal ion stabilizes a kink in the mRNA that demarcates the boundary between A and P sites, which is potentially important to prevent slippage of mRNA. Metal ions also stabilize the intersubunit interface. The interactions of E-site tRNA with the 50 S subunit have both similarities and differences compared to those in the archaeal ribosome. The structure also rationalizes much biochemical and genetic data on translation.

Ribosomes Caught in Translation To synthesize proteins, the ribosome must select cognate transfer RNAs (tRNAs) based on base-pairing with the messenger RNA (mRNA) template (a process known as decoding), form a peptide bond, and then move the mRNA:tRNA assembly relative to the ribosome (a process known as translocation). Decoding and translocation require protein guanosine triphosphatases (GTPases), and, while high-resolution structures of the ribosome have greatly furthered our understanding of ribosome function, the detailed mechanism of these GTPases during the elongation cycle remains unclear. Two Research Articles now give a clearer view of these steps in bacterial protein synthesis (see the Perspective by Liljas ). Schmeing et al. (p. 688 , published online 15 October) present the crystal structure of the ribosome bound to Elongation factor-Tu (EF-Tu) and amino-acyl tRNA that gives insight into how EF-Tu contributes to accurate decoding. Gao et al. (p. 694 , published online 15 October) describe the crystal structure of the ribosome bound to Elongation factor-G (EF-G) trapped in a posttranslocation state by the antibiotic fusidic acid that gives insight into how EF-G functions in translocation.

The successful production of recombinant protein for biochemical, biophysical and structural biological studies critically depends on the correct expression organism. Currently the most commonly used expression organisms for structural studies are E. coli (ca. 70% of all PDB structures) and the baculovirus/ insect cell expression system (ca. 5% of all PDB structures). While insect cell expression is frequently successful for large eukaryotic proteins, it is relatively expensive and time consuming compared to E. coli expression. Frequently the decision to carry out a baculovirus project means restarting cloning from scratch. Here we describe an integrated system that allows the simultaneous cloning into E. coli and baculovirus expression vectors using the same PCR products. The system offers a flexible array of N- and C-terminal affinity, solublisation and utility tags, and the speed allows expression screening to be completed in E. coli , before carrying out time and cost intensive experiments in baculovirus. Importantly, we describe a means of rapidly generating polycistronic bacterial constructs based on the hugely successful biGBac system, making InteBac of particular interest for researchers working on recombinant protein complexes.

Programmed DNA double-strand break (DSB) formation is a unique meiotic feature that initiates recombination-mediated linking of homologous chromosomes, thereby enabling chromosome number halving in meiosis. DSBs are generated on chromosome axes by heterooligomeric focal clusters of DSB-factors. Whereas DNA-driven protein condensation is thought to assemble the DSB-machinery, its targeting to chromosome axes is poorly understood. We discovered in mice that efficient biogenesis of DSB-machinery clusters requires seeding by axial IHO1 platforms, which are based on a DBF4-dependent kinase (DDK)-modulated interaction between IHO1 and the chromosomal axis component HORMAD1. IHO1-HORMAD1-mediated seeding of the DSB-machinery on axes ensures sufficiency of DSBs for efficient pairing of homologous chromosomes. Without IHO1-HORMAD1 interaction, residual DSBs depend on ANKRD31, which enhances both the seeding and the growth of DSB-machinery clusters. Thus, recombination initiation is ensured by complementary pathways that differentially support seeding and growth of DSB-machinery clusters, thereby synergistically enabling DSB-machinery condensation on chromosomal axes.

Abstract Teleost fish of the genus Danio are excellent models to study the genetic and cellular bases of pigment pattern variation in vertebrates. The two sister species Danio rerio and Danio aesculapii show divergent patterns of horizontal stripes and vertical bars that are partly caused by the evolution of the potassium channel gene kcnj13 . In D. rerio, kcnj13 is required in melanophores for interactions with xanthophores and iridophores, which cause location-specific pigment cell shapes and thereby influence colour pattern and contrast. Here, we show that cis-regulatory rather than protein coding changes underlie kcnj13 evolution between the two species. D. aesculapii express lower kcnj13 levels and exhibit low-contrast patterns similar to D. rerio mutants. Our results suggest that homotypic and heterotypic interactions between the pigment cells and their shapes diverged between species by quantitative changes in kcnj13 expression during pigment pattern diversification.

Mutations in

Abstract In mitosis, sequences on sister chromatids are preferred as DNA repair templates, whereas in meiosis interhomolog-based repair is promoted. The switch of template preference during homologous recombinational (HR) repair of DNA breaks is a defining event in sexual reproduction. This preference is needed to establish linkages between homologous chromosomes that support meiotic chromosome segregation. In budding yeast, a central activity that enforces meiotic interhomolog bias is encoded in a meiosis-specific protein kinase complex, consisting of Red1, Hop1 and Mek1 ( i.e., the RHM complex). Activation of Mek1 kinase in meiosis – dictated by complex formation and upstream DNA break-dependent signaling – leads to modification of HR factors and the establishment of interhomolog HR repair bias. How meiotic repair bias is established is a central question with implications for sexual reproduction, genetic diversity and genome stability. Studying the role of the RHM complex in DNA repair is complicated by the fact that Red1 and Hop1 are required for efficient meiotic DNA break formation. Here, we conditionally express RHM components in mitotically-dividing cells to show that these factors can autonomously establish the RHM complex outside of its physiological environment. In vivo analysis is complemented with in vitro biochemical reconstitution to analyze the composition of a Red1-Hop1 subcomplex. The RHM complex can be activated under DNA damaging conditions in mitotically-dividing cells, and activation depends on upstream Mec1 kinase function. We use this system to perform a structure-function analysis of RHM complex formation and Mek1 activation. Finally, we demonstrate that expressing active Mek1 in mitosis leads to rad51Δ -like DNA break sensitivity, suggesting that activation of the RHM complex is sufficient to reconstitute (parts of) its physiological function in mediating HR-based repair. This system should enable querying downstream effects of RHM complex action on DNA repair dynamics and template bias. Human homologs of Red1 and Hop1 are often aberrantly re-expressed in cancer cells. Our system has the potential to inform on (dys)functional effects of these genes on genome stability during human tumorigenesis.

During meiosis I it is necessary that homologous chromosomes are linked to one another so that they can be faithfully separated. S. cerevisiae Mer3 (HFM1 in mammals) is a SF2 helicase and member of the ZMM group of proteins, that facilitates the formation of class I crossovers during meiosis. Here we describe the structural organisation of Mer3 and, using AlphaFold modelling and XL-MS, we further characterise the previously described interaction with Mlh1-Mlh2. We find that Mer3 also forms a previously undescribed complex with the recombination regulating factors Top3 and Rmi1 and that this interaction is competitive with Sgs1 BLM helicase in a phospho-dependent manner. Using in vitro reconstituted D-loop assays we show that Mer3 inhibits the anti-recombination activity of Sgs1/Top3/Rmi1 (STR) complex. Thus we provide a mechanism whereby Mer3 downregulates the anti-crossover activity of the STR complex, hence promoting the formation of crossovers during meiosis I.

In meiosis, DNA double strand break (DSB) formation by Spo11 initiates recombination and enables chromosome segregation. Numerous factors are required for Spo11 activity, and couple the DSB machinery to the development of a meiosis-specific ?axis-tethered loop? chromosome organization. Through in vitro reconstitution and budding yeast genetics we here provide architectural insight into the DSB machinery by focussing on a foundational DSB factor, Mer2. We characterise the interaction of Mer2 with the histone reader Spp1, and show that Mer2 directly associates to nucleosomes, likely highlighting a contribution of Mer2 to tethering DSB factors to chromatin. We reveal the biochemical basis of Mer2 association with Hop1, a HORMA domain-containing chromosomal axis factor. Finally, we identify a conserved region within Mer2 crucial for DSB activity, and show that this region of Mer2 establishes an interaction with the DSB factor Mre11. In combination with previous work, we establish Mer2 as a keystone of the DSB machinery by bridging key protein complexes involved in the initiation of meiotic recombination.

ORC (Orc1-6) is an AAA+ complex that loads the AAA+ MCM helicase to replication origins. Orc1, a subunit of ORC, functionally interacts with budding yeast Pch2, a meiosis-specific AAA+ protein. Pch2 regulates several chromosomal events of gametogenesis, but mechanisms that dictate Pch2 function remain poorly understood. We demonstrate that ORC directly interacts with an AAA+ Pch2 hexamer. The ORC-Pch2 assembly is established without Cdc6, a factor crucial for ORC-MCM binding. Biochemical analysis suggests that Pch2 utilizes ORCs Cdc6-binding interface and employs its non-enzymatic NH2-terminal domain and AAA+ core to engage ORC. In contrast to phenotypes observed upon Orc1 impairment, nuclear depletion of other subunits of ORC does not lead to Pch2-like phenotypes, indicating that ORC integrity per se is not required to support Pch2 function. We thus reveal functional interplay between Pch2 and ORC, and uncover the repurposing of ORC to establish a non-canonical and meiosis-specific AAA+ assembly.