The development of noninvasive methods to detect and monitor tumors continues to be a major challenge in oncology. We used digital polymerase chain reaction-based technologies to evaluate the ability of circulating tumor DNA (ctDNA) to detect tumors in 640 patients with various cancer types. We found that ctDNA was detectable in >75% of patients with advanced pancreatic, ovarian, colorectal, bladder, gastroesophageal, breast, melanoma, hepatocellular, and head and neck cancers, but in less than 50% of primary brain, renal, prostate, or thyroid cancers. In patients with localized tumors, ctDNA was detected in 73, 57, 48, and 50% of patients with colorectal cancer, gastroesophageal cancer, pancreatic cancer, and breast adenocarcinoma, respectively. ctDNA was often present in patients without detectable circulating tumor cells, suggesting that these two biomarkers are distinct entities. In a separate panel of 206 patients with metastatic colorectal cancers, we showed that the sensitivity of ctDNA for detection of clinically relevant KRAS gene mutations was 87.2% and its specificity was 99.2%. Finally, we assessed whether ctDNA could provide clues into the mechanisms underlying resistance to epidermal growth factor receptor blockade in 24 patients who objectively responded to therapy but subsequently relapsed. Twenty-three (96%) of these patients developed one or more mutations in genes involved in the mitogen-activated protein kinase pathway. Together, these data suggest that ctDNA is a broadly applicable, sensitive, and specific biomarker that can be used for a variety of clinical and research purposes in patients with multiple different types of cancer.

There are currently few therapeutic options for patients with pancreatic cancer, and new insights into the pathogenesis of this lethal disease are urgently needed. Toward this end, we performed a comprehensive genetic analysis of 24 pancreatic cancers. We first determined the sequences of 23,219 transcripts, representing 20,661 protein-coding genes, in these samples. Then, we searched for homozygous deletions and amplifications in the tumor DNA by using microarrays containing probes for ∼10 6 single-nucleotide polymorphisms. We found that pancreatic cancers contain an average of 63 genetic alterations, the majority of which are point mutations. These alterations defined a core set of 12 cellular signaling pathways and processes that were each genetically altered in 67 to 100% of the tumors. Analysis of these tumors' transcriptomes with next-generation sequencing-by-synthesis technologies provided independent evidence for the importance of these pathways and processes. Our data indicate that genetically altered core pathways and regulatory processes only become evident once the coding regions of the genome are analyzed in depth. Dysregulation of these core pathways and processes through mutation can explain the major features of pancreatic tumorigenesis.

International experts met to discuss recent advances and to revise the 2004 recommendations for assessing and reporting precursor lesions to invasive carcinomas of the pancreas, including pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN), intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN), mucinous cystic neoplasm, and other lesions. Consensus recommendations include the following: (1) To improve concordance and to align with practical consequences, a 2-tiered system (low vs. high grade) is proposed for all precursor lesions, with the provision that the current PanIN-2 and neoplasms with intermediate-grade dysplasia now be categorized as low grade. Thus, “high-grade dysplasia” is to be reserved for only the uppermost end of the spectrum (“carcinoma in situ”–type lesions). (2) Current data indicate that PanIN of any grade at a margin of a resected pancreas with invasive carcinoma does not have prognostic implications; the clinical significance of dysplasia at a margin in a resected pancreas with IPMN lacking invasive carcinoma remains to be determined. (3) Intraductal lesions 0.5 to 1 cm can be either large PanINs or small IPMNs. The term “incipient IPMN” should be reserved for lesions in this size with intestinal or oncocytic papillae or GNAS mutations. (4) Measurement of the distance between an IPMN and invasive carcinoma and sampling of intervening tissue are recommended to assess concomitant versus associated status. Conceptually, concomitant invasive carcinoma (in contrast with the “associated” group) ought to be genetically distinct from an IPMN elsewhere in the gland. (5) “Intraductal spread of invasive carcinoma” (aka, “colonization”) is recommended to describe lesions of invasive carcinoma invading back into and extending along the ductal system, which may morphologically mimic high-grade PanIN or even IPMN. (6) “Simple mucinous cyst” is recommended to describe cysts >1 cm having gastric-type flat mucinous lining at most minimal atypia without ovarian-type stroma to distinguish them from IPMN. (7) Human lesions resembling the acinar to ductal metaplasia and atypical flat lesions of genetically engineered mouse models exist and may reflect an alternate pathway of carcinogenesis; however, their biological significance requires further study. These revised recommendations are expected to improve our management and understanding of precursor lesions in the pancreas.

More information is needed about genetic factors that initiate development of pancreatic intraepithelial neoplasms—the most common precursors of pancreatic ductal adenocarcinoma. We show that more than 99% of the earliest-stage, lowest-grade, pancreatic intraepithelial neoplasm-1 lesions contain mutations in KRAS, p16/CDKN2A, GNAS, or BRAF. These findings could improve our understanding of the development and progression of these premalignant lesions. More information is needed about genetic factors that initiate development of pancreatic intraepithelial neoplasms—the most common precursors of pancreatic ductal adenocarcinoma. We show that more than 99% of the earliest-stage, lowest-grade, pancreatic intraepithelial neoplasm-1 lesions contain mutations in KRAS, p16/CDKN2A, GNAS, or BRAF. These findings could improve our understanding of the development and progression of these premalignant lesions. Pancreatic cancer is the fourth leading cause of cancer death in the United State.1Vincent A. et al.Lancet. 2011; 378: 607-620Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1710) Google Scholar Pancreatic intraepithelial neoplasms (PanINs) are the most common precursor to invasive pancreatic adenocarcinoma.2Hruban R.H. et al.Clin Cancer Res. 2000; 6: 2969-2972PubMed Google Scholar They are microscopic lesions (<5 mm diameter), and almost always too small to be identified by current imaging. Low-grade PanINs (PanIN-1) are common and their prevalence increases with age, whereas high-grade PanINs are uncommon and usually are found in pancreata with invasive pancreatic cancer. Multiple PanINs of all grades frequently are observed in individuals with inherited susceptibility to pancreatic cancer.3Shi C. et al.Clin Cancer Res. 2009; 15: 7737-7743Crossref PubMed Scopus (154) Google Scholar More than 90% of invasive adenocarcinomas of the pancreas harbor oncogenic mutations in KRAS whereas BRAF mutations occur in a small subset of KRAS-wild-type pancreatic cancers.1Vincent A. et al.Lancet. 2011; 378: 607-620Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1710) Google Scholar, 4Jones S. et al.Science. 2008; 321: 1801-1806Crossref PubMed Scopus (3043) Google Scholar Almost all invasive pancreatic cancers inactivate p16/CDKN2A. GNAS is mutated in approximately 60% of intraductal papillary mucinous neoplasms (IPMNs), and in some invasive pancreatic cancers arising in association with an IPMN.5Wu J. et al.Sci Transl Med. 2011; 3 (92ra66)Crossref Scopus (99) Google Scholar Several genetic alterations identified in invasive pancreatic adenocarcinomas also are present in PanINs, with evidence of increasing prevalence of these alterations with PanIN grade.2Hruban R.H. et al.Clin Cancer Res. 2000; 6: 2969-2972PubMed Google Scholar However, the genes responsible for early PanIN development remain poorly understood. Thus, a meta-analysis evaluating studies of mutant KRAS prevalence in PanINs found that among patients with pancreatic ductal adenocarcinoma, KRAS mutations were detected by conventional methods in 36% of PanIN-1A, 44% of PanIN-1B, and 87% of high-grade PanIN lesions (PanIN-2 and PanIN-3).6Lohr M. et al.Neoplasia. 2005; 7: 17-23Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar Data such as these indicate that KRAS mutations are more involved after PanIN initiation; genetic alterations that initiate tumorigenesis should have the same prevalence, independent of grade. The goal of the current study was to use more sensitive mutation detection methods to obtain a more detailed genetic understanding of early PanIN development. For this purpose, first we used laser capture to microdissect 169 PanINs (50 PanIN-1A, 52 PanIN-1B, 45 PanIN-2, and 22 PanIN-3 lesions) from 89 patients with benign and malignant pancreatic diseases (Supplementary Table 1; Figure 1A), invasive pancreatic ductal adenocarcinomas from 12 patients, and normal pancreatic ducts from 20 patients. After DNA isolation and whole-genome amplification, DNA was analyzed for somatic mutations in KRAS, BRAF, GNAS, and p16/CDKN2A using pyrosequencing and high-resolution melt-curve analysis. The limit of detection of these assays is approximately 5% (ie, mutant alleles can be detected at concentrations of 5% or more [mutant: wild-type alleles, 1:20, cells, 1:10]) (see Supplementary Materials and Methods section). By using pyrosequencing, KRAS codon 12 mutations were detected in 46 (92.0%) of 50 PanIN-1A, 48 (92.3%) of 52 PanIN-1B, 42 (93.3%) of 45 PanIN-2, and 21 (95.4%) of 22 PanIN-3 lesions (Supplementary Table 2). Occasional mutations of KRAS codon 13 and codon 61 were identified (Supplementary Table 2), and a second nondominant KRAS mutation was found in 6 of 169 PanINs. No evidence of KRAS amplification was found. Melt-curve analysis confirmed the presence of KRAS gene mutations in every sample that was positive by pyrosequencing (Supplementary Figure 1A). Overall, 163 of 169 (96.4%) PanINs harbored KRAS mutations. No KRAS mutations were identified in normal pancreatic duct samples (Supplementary Table 2). Five of the 169 PanIN lesions tested by pyrosequencing had a second minor KRAS codon 12 mutation. Many PanIN-1 lesions had low mutant KRAS concentrations (mean, ∼20% of alleles by pyrosequencing, Supplementary Table 3), perhaps explaining why prior studies reported a lower prevalence of KRAS mutations in low-grade PanINs. To check the purity of our laser capture microdissection, we repeated the microdissections from 16 of the PanINs, using another set of slides. The mutant KRAS concentrations in DNA from the second microdissection were not significantly different from those of the first microdissections (Supplementary Materials and Methods). We also analyzed mutant KRAS concentrations in invasive pancreatic adenocarcinomas, and these samples had close to the concentrations of mutant KRAS one would expect if they consisted entirely of KRAS-mutant cancer cells without any contaminating wild-type (and presumably non-neoplastic) cells (mean, 42.5% of KRAS alleles, not significantly different from the mean mutant KRAS allele concentration in PanIN-3 lesions). Indeed, we found that the average concentration of mutant KRAS alleles in PanINs increased significantly with increasing grade of PanIN (Figure 1C, Figure 2). These results indicate that virtually all PanINs harbor KRAS mutations. However, in the earliest PanIN lesions, these mutations are generally present in only a fraction of the cells comprising the lesion. The percentage of mutant KRAS cells in the PanIN progressively increases with the PanIN grade, consistent with a gradual expansion of the KRAS-mutant clone as the PanIN progresses. We then sought to determine if mutations in other genes are present in the few KRAS–wild-type PanINs, particularly low-grade PanINs. Because prior studies have found that TP53 and SMAD4 mutations do not appear until late in the neoplastic progression, we focused on BRAF because it sometimes is mutant in KRAS wild-type cancers; on p16/CDKN2A because loss of p16/CDKN2A expression has been found in some early PanINs; and GNAS because it commonly is mutated in another type of premalignant pancreatic lesion (IPMNs).5Wu J. et al.Sci Transl Med. 2011; 3 (92ra66)Crossref Scopus (99) Google Scholar Although p16/CDKN2A mutations were identified in only 17 of 147 PanIN-1/2 lesions (11.5%), they were detected more often in KRAS–wild-type PanINs than in KRAS-mutant PanINs (P = .0209). A similar trend was noted for GNAS mutations, which were the only mutations identified in 2 PanINs (P = .0886; Figure 2). Interestingly, similar to what was found for some IPMNs,5Wu J. et al.Sci Transl Med. 2011; 3 (92ra66)Crossref Scopus (99) Google Scholar among PanIN-1/2 lesions with both GNAS and KRAS mutations, mutant GNAS concentrations were higher than mutant KRAS (P = .0084, paired t test) (Supplementary Table 2), suggesting that low mutant KRAS concentrations in PanIN samples were not simply the result of contamination with DNA from nearby stromal cells. It also suggests that in some PanINs, the KRAS mutation arose later than the GNAS mutation. There were no histologic differences in cell morphology within PanIN-1 lesions with low vs high concentrations of either mutant KRAS or GNAS (Supplementary Figure 1). GNAS mutations were detected more often in PanINs from patients with a diagnosis other than pancreatic adenocarcinoma (P = .0398). Overall, we were able to identify at least one mutation in KRAS, GNAS p16/CDKN2A, or BRAF in all but 1 of 169 PanINs (Supplementary Table 1, Supplementary Table 2). No mutant KRAS or GNAS was detected in this one wild-type PanIN (patient 72), even with the sensitive techniques we used (detection limit <1%). To confirm the prevalence of KRAS and GNAS mutations in PanINs, we also conducted an independent analysis of an additional 37 PanIN lesions (11 PanIN-1, 20 PanIN-2, and 7 PanIN-3 lesions) using 2 additional ultrasensitive technologies: digital ligation (limit of detection, 1/200 alleles) and Beads, Emulsion, Amplification (BEAM)ing (limit of detection, 1/1000 alleles) (Supplementary Materials and Methods), and found KRAS mutations in 94.6% of PanINs and GNAS mutations in 11.4% (Supplementary Table 4), with complete concordance of the mutation results with both platforms. A second nondominant KRAS mutation was found more often using these methods than by pyrosequencing, consistent with the lower limit of detection of these assays. These results indicate that somatic mutations are required for the early development of virtually all PanINs. Our results are consistent with observations in genetically engineered mouse models in which mouse PanINs can be initiated by oncogenic KRAS.7Hingorani S.R. et al.Cancer Cell. 2003; 4: 437-450Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1738) Google Scholar Although low-grade PanIN cells have some metaplastic features, our results do not support the hypothesis that PanINs begin as metaplasias and only subsequently acquire genetic alterations. If this were true, more low-grade (early) PanINs would lack oncogenic mutations. (We found only 1 of 102 PanIN-1 lesions lacked a mutation.) In prior studies, we have examined the metaplastic lesion known as acinar-to-ductal metaplasia for evidence of genetic alterations (mutant KRAS and telomere length analysis) and did not find evidence from this analysis that acinar-to-ductal metaplasias are precursors to PanINs. The findings that many low-grade PanINs contain mixtures of mutant and wild-type KRAS cells, that GNAS mutation concentrations can be higher than KRAS mutation concentrations in the same PanIN, and that the average proportion of mutant KRAS within PanINs increases with PanIN grade, suggests that mutant KRAS alone provides only a modest selective advantage over neighboring cells. This finding suggests that the KRAS-mutant clone is partially restrained within the PanIN, possibly by oncogene-induced senescence8Caldwell M.E. et al.Oncogene. 2011 Aug 22; ([Epub ahead of print])PubMed Google Scholar, 9Lee K.E. et al.Cancer Cell. 2010; 18: 448-458Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (105) Google Scholar and this restraint likely is maintained until additional genetic and/or epigenetic events (such as p16/CDKN2A inactivation) occur. The driving force behind the expansion of cells within PanINs that do not harbor mutant KRAS is not certain. One possibility is that PanIN-initiating event(s) precede oncogenic KRAS mutations. However, our genome4Jones S. et al.Science. 2008; 321: 1801-1806Crossref PubMed Scopus (3043) Google Scholar and methylome10Vincent A. et al.Clin Cancer Res. 2011; 17: 4341-4354Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar studies indicate there are no other commonly mutated or epigenetically silenced10Vincent A. et al.Clin Cancer Res. 2011; 17: 4341-4354Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar genes in pancreatic cancers that stand out as candidate initiators of PanIN development. Telomere shortening is observed in almost all low-grade PanINs11van Heek N.T. et al.Am J Pathol. 2002; 161: 1541-1547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (280) Google Scholar but this phenomenon could be a consequence of activation of oncogene stress–induced senescence programs12Ben-Porath I. et al.J Clin Invest. 2004; 113: 8-13Crossref PubMed Scopus (321) Google Scholar rather than an initiator of PanINs. One unifying hypothesis to explain all these observations is that KRAS, and occasionally p16/CDKN2A, GNAS, or BRAF, mutations can initiate PanIN development, and that these mutant cells induce surrounding cells to proliferate. Such proliferation could come from autocrine and paracrine influences from KRAS-mutant PanIN cells, such as expression of sonic hedgehog, and other developmental genes,13Strobel O. et al.Gastroenterology. 2010; 138: 1166-1177Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (114) Google Scholar, 14Prasad N.B. et al.Cancer Res. 2005; 65: 1619-1626Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar as well as stress-inducing signals that lead to senescence,15Kuilman T. et al.Nat Rev Cancer. 2009; 9: 81-94Crossref PubMed Scopus (610) Google Scholar and induce metaplastic features in PanIN epithelial cells including adjacent cells lacking KRAS mutations. The authors thank Ms Bona Kim for providing the pancreatic intraepithelial neoplasm illustration (Figure 2). All elements of this investigation were approved by The Johns Hopkins Medical Institutional Review Board and written informed consent was obtained from all patients. PanINs were identified at the time of frozen-section analysis of pancreatic resection specimens by R.H.H. from 2007 to 2010 as microscopic papillary or flat noninvasive epithelial neoplasms arising in a pancreatic duct, composed of cuboidal to columnar cells with varying amounts of mucin and degrees of cytologic and architecture atypia. PanINs were graded further into PanIN-1A, PanIN-1B, PanIN-2, and PanIN-3 lesions based on the degree of cytologic and architectural atypia.1Hruban R.H. et al.Am J Surg Pathol. 2001; 25: 579-586Crossref PubMed Scopus (945) Google Scholar Frozen sections were placed on ultraviolet-irradiated, membrane-coated slides (Carl Zeiss Microimaging, München, Germany). Slides were stained with H&E. Briefly, nuclei were stained with hematoxylin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for 10 minutes, and the cytoplasm was stained with eosin (Sigma-Aldrich) for 5 minutes after consecutive rehydration with 100%, 96%, and 70% ethanol for 1 minute each. The stained slides were microdissected within 2 hours by an LCM system (Leica LMD7000; Leica, Buffalo Grove, IL). Care was taken to ensure that PanINs were not pooled inadvertently. Pancreatic ducts that contained 2 different grades of PanINs within the same duct were excluded from dissection. We did not pool dissections of PanIN cells from different ducts even when they were on the same slide; these are probably different from PanINs. Because each tissue section is only 10-umol/L thick, a PanIN lesion is typically many sections deep. Therefore, we typically dissected cells from one PanIN from several adjacent slides (3–5 slides). Usually, a PanIN can be followed along adjacent tissue sections and can be identified from landmarks such as the shape of the duct and the morphology of the cells and of the surrounding areas of acinar cells and islets. In the first set of cases, 50 PanIN-1A, 52 PanIN-1B, 45 PanIN-2, and 22 PanIN-3 were obtained from 89 individual patients, including 53 patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (Supplementary Table 1). In the second set of cases, 37 PanINs were analyzed (11 PanIN-1, 20 PanIN-2, and 7 PanIN-3 lesions) from 32 individuals (Supplementary Table 3). Genomic DNA was extracted from the microdissected tissues using the QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA). Whole-genome amplification was conducted for all extracted DNA samples with REPLI-g Mini Kit (Qiagen) and incubation time was 16 hours. DNA samples were quantified by Quantifiler (Applied Biosystems, Foster City, CA) before and after whole-genome amplification. The mutational status of KRAS, GNAS, and BRAF was investigated by pyrosequencing. Ten nanograms of whole-genome amplified DNAs were polymerase chain reaction amplified with the PyroMark polymerase chain reaction Kit (Qiagen) according to the manufacturer’s protocol. After amplification, 20 μL of biotinylated polymerase chain reaction product was immobilized on streptavidin-coated sepharose beads (streptavidin sepharose high performance; GE Health care Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). The purified biotinylated polymerase chain reaction product was released into the PyroMark Q24 (Biotage AB, Uppsala, Sweden) with PyroMark Gold reagents (Qiagen) containing 0.3 μmol/L sequencing primer and annealing buffer. In addition to detection of mutations of each gene, the peaks of pyrograms, indicating populations of mutant, were investigated in all samples. To determine the limit of detection of pyrosequencing for KRAS mutations, a stepwise dilution series (0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, and 100%) was performed using the MiaPaCa2 pancreatic cancer cell line known to have a homozygous KRAS mutation (GGT>GTT, G12V). This analysis showed that pyrosequencing could identify mutant KRAS concentrations of 5% or more and accurately reflect mutant concentrations Figure 1B). To ensure that we accurately determined samples with low mutant KRAS concentrations, any samples with less than 10% mutant KRAS concentrations were rechecked by repeating the laser capture microdissection of adjacent slides of the same PanIN and then repeating the pyrosequencing. Representative pyrograms are shown in Figure 1D. There was no significant difference in mutant KRAS concentrations in the paired samples (Student paired t test). Although each PanIN was dissected to avoid all contaminating normal stromal cells, to ensure that our microdissections were not removing stromal cells near the basement membrane of the PanINs, we next repeated the laser microdissections of 6 PanIN lesions, this time dissecting the cytoplasm of the PanINs to avoid the basement membrane and any adjacent stromal cells. Again, we found no significant difference in mutant KRAS concentrations between these microdissected samples and the previous microdissections of the same PanINs. The mutational status of exons 1–2 of p16/CDKN2A was investigated with high-resolution melt-curve analysis. High-resolution melt-curve analysis targeting KRAS codons 12 and 13 also was performed on all samples to confirm results of the KRAS pyrosequencing. The polymerase chain reactions for high-resolution melt-curve analysis were 5 μL volume for each well containing 10 ng of whole-genome amplified DNAs, 2× concentration amplification buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.3 mmol/L deoxynucleoside triphosphate mix, 1 mmol/L MgSO4, 0.02 U/μL Platinum pfx polymerase (Invitrogen), 8% dimethyl sulfoxide, 0.1 U/μL LcGreen+ dye (Idaho Tech, Salt Lake City, UT), and 200 nmol/L forward and reverse primers. All samples were tested in triplicate. In each polymerase chain reaction plate, 5 wells were allocated to wild-type control DNA and 1 well to nontemplate control to validate the polymerase chain reaction. For the KRAS assay, 3 wells of MiaPaCa2 DNA was included as a positive control for mutant KRAS. The germline DNA of patients with positive PanIN high-resolution melt-curve analysis results for p16/CDKN2A mutations also was analyzed by high-resolution melt-curve analysis or sequenced using Sanger sequencing to identify any germline p16/CDKN2A variants. No germline p16/CDKN2A variants were identified. After the polymerase chain reaction, the plate was transferred immediately to the LightScanner mutation analyzer (Idaho Tech), setting a melt temperature range between 72°C and 98°C. Scanning data were analyzed by the LightScanner software. A fluorescence difference of 5% was set as a cut-off level for identifying variant samples as suggested in previous reports and confirmed by our own dilution curves with positive controls.2Erali M. et al.Methods. 2010; 50: 250-261Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar Representative results of high-resolution melt-curve analysis are shown in Supplementary Figure 1B. For the 6 PanINs in the first set of 169 PanINs found to be wild-type for KRAS, we used digital melt curve analysis to test for low mutant DNA concentrations using the same conditions described earlier but analyzing PanIN DNA in 96 wells and 10 genome equivalents per well (limit of detection, <1%).3Zou H. et al.Gastroenterology. 2009; 136: 459-470Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (84) Google Scholar No mutations in KRAS were identified in any of these PanINs. For the one PanIN in the first set of 169 PanINs that was wild-type for all 4 genes tested, we also used digital melt curve analysis to test for low mutant DNA concentrations of GNAS. No GNAS mutation was identified in this PanIN. Aberrant KRAS amplification was evaluated with real-time quantitative polymerase chain reaction. Ten nanograms of DNA samples of wild-type control, positive control (Pa08C, pancreatic cancer cell line with aberrantly increased KRAS amplification), and PanIN samples were used as a template after being quantified precisely by the Quantifiler. Real-time detection of the emission intensity of SYBR Green was performed with the 7900HT Fast Real-Time polymerase chain reaction System (Applied Biosystems). Threshold cycles (Ct value) of samples were compared between wild-type control, positive control, and PanIN samples. Digital ligation was used to identify KRAS codon 12 and GNAS codon 201 mutations on the independent set of 37 PanINs and was performed as previously described.4Wu J. et al.Sci Transl Med. 2011; 3 (92ra66)Crossref Scopus (131) Google Scholar BEAMing assays were performed on the independent set of 37 PanINs to confirm the digital ligation results as previously described.5Diehl F. et al.Nat Med. 2008; 14: 985-990Crossref PubMed Scopus (1753) Google Scholar The sequences of the PCR primers used in this study are and their conditions are provided in Supplementary Table 5. Mean pyrogram peaks of each PanIN group were compared with the Mann–Whitney U test. We used a paired t test to analyze the differences in concentration of mutant between KRAS codon 12 and GNAS. The correlation between mutational status of the PanIN and the pathologic diagnosis of the lesion that led to the patient’s pancreatic resection was analyzed by the Fisher exact test. Association of mutational status of each gene also was analyzed by the Fisher exact test. Statistical analysis was performed using SPSS Statistics 17.0 software (SPSS, Chicago, IL). A P value of less than .05 was considered statistically significant.Supplementary Table 1List of Patients Enrolled in This StudySexAgePathologic diagnosisPanINs analyzed1Male70Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 22Male60IPMNPanIN-1A3Male69Ductal adenocarcinomaPanIN-1B4Male65CholangiocarcinomaPanIN-1A, 2, 35Male72Duodenum adenocarcinomaPanIN-1A, 26Female74Chronic pancreatitisPanIN-1A, 1B, 27Female66Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 28Male76Bile duct adenomaPanIN-1B9Female79Ductal adenocarcinomaPanIN-1A10Female76Ductal adenocarcinomaPanIN-1B, 211Male69Ductal adenocarcinomaPanIN-1B, 212Female72Ductal adenocarcinomaPanIN-1A13Male50Ductal adenocarcinomaPanIN-314Female67Pancreatic endocrine neoplasmPanIN-1B, 215Male62IPMNPanIN-1BaHighlighted PanINs were KRAS wild-type.16Female37Chronic pancreatitisPanIN-1A17Female56Ductal adenocarcinomaPanIN-1A18Male85Metastatic neoplasmPanIN-1A, 219Male63Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 220Female69Ductal adenocarcinomaPanIN-1B, 2aHighlighted PanINs were KRAS wild-type.21Male83Metastatic neoplasmPanIN-1A, 1B, 222Male61Serous cystadenomaPanIN-223Female71Ductal adenocarcinomaPanIN-1B24Female74Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 225Female76Ductal adenocarcinomaPanIN-1B26Female60Chronic pancreatitisPanIN-1A27Male79Ductal adenocarcinoma, IPMNPanIN-1A28Female58Pancreatic endocrine neoplasmPanIN-1A29Male62Adenosquamous carcinomaPanIN-1B, 230Female51IPMNPanIN-1B31Female58IPMNPanIN-1A, 232Male61IPMNPanIN-1B33Female65Ductal adenocarcinomaPanIN-334Male50Ductal adenocarcinomaPanIN-1B, 235Female64Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 236Female52IPMNPanIN-1A, 337Female66Ductal adenocarcinomaPanIN-1A38Female66Chronic pancreatitisPanIN-1B, 2, 339Female58IPMNPanIN-1BaHighlighted PanINs were KRAS wild-type.40Male63Ductal adenocarcinomaPanIN-241Male55IPMNPanIN-1B42Female67Pancreatic endocrine neoplasmPanIN-1B43Female60Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 244Female69Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 2, 345Female66Ductal adenocarcinomaPanIN-1B, 246Female59Ductal adenocarcinomaPanIN-2, 347Male76IPMNPanIN-2, 348Male75Ductal adenocarcinomaPanIN-1B, 2, 349Female45Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 250Male65IPMNPanIN-1A, 1B, 251Female55Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B52Male85IPMNPanIN-1A, 1B53Male74Ductal adenocarcinomaPanIN-2, 354Female52Serous cystadenomaPanIN-1A, 1B55Female62Pancreatic endocrine neoplasmPanIN-1B56Female75Chronic pancreatitisPanIN-1B, 257Female56IPMNPanIN-1A, 1B, 258Female70Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B59Female78Ductal adenocarcinomaPanIN-2, 360Female63Ductal adenocarcinomaPanIN-361Female54Ductal adenocarcinomaPanIN-362Female64Ductal adenocarcinomaPanIN-2, 363Male73Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B64Female73Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 265Male55Pancreatic endocrine neoplasmPanIN-1A, 1B66Male59Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B67Female61Chronic pancreatitisPanIN-1A, 1B68Male68Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 269Female89Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B70Female86Serous cystadenomaPanIN-1A, 1B71Male73Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 2, 372Female58Mucinous cystadenomaPanIN-1AaHighlighted PanINs were KRAS wild-type.,bNo mutations identified in any gene tested.73Female60Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B74Male57Ductal adenocarcinomaPanIN-2aHighlighted PanINs were KRAS wild-type.75Female63Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 276Female63Ampullary adenomaPanIN-1A, 1B77Female71Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B78Female60Ductal adenocarcinoma, IPMNPanIN-379Female63Ductal adenocarcinomaPanIN-380Female54Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 281Male58Ductal adenocarcinomaPanIN-2, 382Male63Chronic pancreatitisPanIN-1B83Male63Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 284Male73Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 2, 385Male72Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 386Female69Ductal adenocarcinomaPanIN-1A, 1B, 2, 387Male49Ductal adenocarcinomaPanIN-388Male75Ductal adenocarcinomaPanIN-289Female58IPMNPanIN-1A, 2a Highlighted PanINs were KRAS wild-type.b No mutations identified in any gene tested. Open table in a new tab Supplementary Table 2Frequency of Mutation in Each GeneKRAS codon 12 WT; GGTKRAS codon 13 WT; GGCKRAS codon 61 WT; CAAKRAS codon 146 WT; GCABRAF codon 600 WT; GTGGNAS codon 201 WT; CGTp16/CKDN2ANormal duct0%0%0%0%0%0%0%PanIN-1A92.0%(46/50)CGT 8GAT 16GTT 21TGT 12.0%(1/50)GAC 14.0%(2/50)CGA 1CTA 10%0%8.0%(4/50)CAT 2TGT 26.0%(3/50)Exon1 1Exon2 2PanIN-1B92.3% (48/52)CGT 9GAT 21GTT 17TGT 10%1.9%(1/52)CAC 10%1.9%(1/52)GAG 15.8%(3/52)CAT 1TGT 29.6%(5/52)Exon1 3Exon2 2Exon1, 2 1PanIN-293.3%(42/45)CGT 6GAT 20GTT 14TGT 20%2.2%(1/45)CGA 10%0%13.3%(6/45)CAT 4TGT 220.0%(9/45)Exon1 3Exon2 5Exon1, 2 1PanIN-395.4%(21/22)CGT 2GAT 12GTT 74.5%(1/22)AGC 19.1%(2/22)CAT 1CGA 10%4.5%(1/22)GAG 14.5%(1/22)CAT 136.4%(7/22)Exon1 3Exon2 3Exon1, 2 1WT, wild-type. Open table in a new tab Supplementary Table 3Concentrations of Mutant KRASKRAS mutationPanIN-1A (n = 50)PanIN-1B (n = 52)PanIN-2 (n = 45)PanIN-3 (n = 22)Pancreatic cancer (n = 12)Codon 127%10%21%28%37%GGT>CG10%18%22%38%81%T16%20%31%(G12R)24%23%31%24%30%34%25%30%30%31%35%32%46%Mean ± SD21.4% ± 9.7%26.7% ± 10.3%29.3% ± 6.5%33.0% ± 7.1%59.0% ± 33.1%Codon 128%6%20%24%25%GGT>G8%8%21%27%31%AT9%8%22%33%46%(G12D)10%12%24%34%55%12%15%24%36%14%15%25%39%16%15%26%40%18%15%26%41%18%16%28%44%22%16%28%46%25%16%29%50%27%19%31%54%29%19%31%31%20%32%41%25%33%42%30%36%30%39%30%40%32%42%33%44%36%Mean ± SD20.6% ± 11.1%19.8% ± 8.9%30.1% ± 7.1%39.0% ± 8.9%39.3% ± 13.7%Codon 12 GGT>GTT (G12V)6%15%21%29%26%7%16%22%31%29%7%16%23%33%37%11%17%24%38%41%11%18%26%39%11%18%27%42%13%18%30%46%13%19%32%17%22%33%18%24%35%18%24%35%20%26%38%20%33%42%20%36%21%38%23%41%23%45%24%25%25%30%Mean ± SD17.3% ± 6.8%25.1% ± 9.8%30.9% ± 7.4%36.9% ± 6.1%33.3% ± 6.9%Codon 12 GGT>TGT (G12C) Mean ± SD15%20%11%25%18.0% ± 9.9%59%Codon 1320% GGC>GAC (G13D)37% GGC>AGC (G13S)51% GGC>AGC (G13S)Codon 61 Mean ± SD29%CAA>CGA(Q61R)49%CAA>CTA (Q61L)39.0% ± 14.1%54%CAA>CAC (Q61H)29%CAA>CGA (Q61R)42%CAA>CGA (Q61R)58%CAA>CAT (Q61H)50.0% ± 11.3%89%CAA>CGA (Q61R)NOTE. The mean PanIN concentrations of mutant KRAS increased with increasing grade of PanINs in each type of mutation.SD, standard deviation. Open table in a new tab Supplementary Table 4Results of KRAS and GNAS Mutation Analysis of the Second Set of PanINsSexAge, yPanINPathologic diagnosisKRASGNAS1Female68PanIN-2Ductal adenocarcinomaG12DNone detected2Female64PanIN-1Ductal adenocarcinomaG12DR201H3Male70PanIN-3Ductal adenocarcinomaG12DNone detected4Female66PanIN-2Ductal adenocarcinomaNone detectedNone detected5Male76PanIN-1Pancreatic endocrine neoplasmNone detectedNone detected6Male57PanIN-2IPMNG12D, G12VNone detected7Female50PanIN-2Serous cystadenomaG12D, G12VR201H8Female61PanIN-2CholangiocarcinomaG12VNone detected9Female67PanIN-1Colloid adenocarcinomaG12RNone detected10Male74PanIN-3Ductal adenocarcinomaG12RNone detected11Female74PanIN-3IPMNG12RR201H12Female74PanIN-3IPMNG12RNone detected13Female57PanIN-1Ductal adenocarcinomaG12RR201H14Female75PanIN-1CholangiocarcinomaG12D, G12VR201H15Female75PanIN-2CholangiocarcinomaG12DR201H16Female75PanIN-3CholangiocarcinomaG12R, G12D, G12VNone detected17Female76PanIN-2Ductal adenocarcinomaG12V, G12DNone detected18Male67PanIN-1Ampullary adenocarcinomaG12VNone detected19Male71PanIN-2Pancreatic endocrine neoplasmG12DNone detected20Female72PanIN-2Ductal adenocarcinomaG12RNone detected21Female57PanIN-2Ductal adenocarcinomaG12VNone detected22Male67PanIN-1Ductal adenocarcinomaG12DR201H, R201C23Female49PanIN-1Ductal adenocarcinomaG12VNone detected24Female79PanIN-2Ductal adenocarcinomaG12VNone detected25Female57PanIN-2Ductal adenocarcinomaG12V, G12RNone detected26Male58PanIN-3IPMNG12DNone detected27Female58PanIN-2Ductal adenocarcinomaG12RNone detected28Female58PanIN-3Ductal adenocarcinomaG12RNone detected29Male56PanIN-2IPMNG12RNone detected30Female40PanIN-1Pancreatic endocrine neoplasmG12D, G12VNone detected31Female56PanIN-1Serous cystadenomaG12D, G12VNone detected32Male46PanIN-2Serous cystadenomaG12DNone detected33Female76PanIN-2Serous cystadenomaG12D, G12VNone detected34Male61PanIN-2GI stromal tumor (GIST) (duodenum)G12VNone detected35Male62PanIN-2IPMNG12DNone detected36Female79PanIN-1Ampullary adenocarcinomaG12RNone detected37Female79PanIN-2Ampullary adenocarcinomaG12RNone detectedNOTE. Combining this set with the first set of PanIN results, GNAS mutations were still more common in patients with a primary diagnosis other than pancreatic cancer (P = .02). Open table in a new tab Supplementary Table 5Primers and Annealing Temperatures Used for Polymerase Chain Reactions in This StudyGeneTargetExperimentTypeOligo sequence (5’–3’)Product sizeAnnealing temperatureKRASCodon 12/13PyrosequencingForwardAGGCCTGCTGAAAATGACTG119 bp52°CPyrosequencingReverseTTGTTGGATCATATTCGTCCACPyrosequencingSequencingGTGGTAGTTGGAGCTHRMForwardAGGCCTGCTGAAAATGACTG119 bp65°CHRMReverseTTGTTGGATCATATTCGTCCAC KRAS amplificationForwardAGGCCTGCTGAAAATGACTG119 bp60°CKRAS amplificationReverseTTGTTGGATCATATTCGTCCAC Codon 61PyrosequencingForwardCAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCA131 bp62°CPyrosequencingReverseCTCATGTACTGGTCCCTCGTTGPyrosequencingSequencingATATTCTCGACACAGCAGCodon 146PyrosequencingForwardAGTTAAGGACTCTGAAGATG157 bp56°CPyrosequencingReverseAGTGTTACTTACCTGTCTTGPyrosequencingSequencingGAATTCCTTTTATTGAAACBRAFCodon 600PyrosequencingForwardATGCTTGCTCTGATAGGAA228 bp59°CPyrosequencingReverseGCATCTCAGGGCCAAAPyrosequencingSequencingTGATTTTGGTCTAGCTACGNASCodon 201PyrosequencingForwardCTGTTTCGGTTGGCTTTGGTG188 bp63°CPyrosequencingReverseAGGGACTGGGGTGAATGTCAAGPyrosequencingSequencingAGGACCTGCTTCGCTGp16/CDKN2AExon 1HRMForwardGAAGAAAGAGGAGGGGCTG340 bp65°CHRMReverseGCGCTACCTGATTCCAATTCExon 2HRMForwardACCCTGGCTCTGACCAT316 bp65°CHRMReverseGCGGGCATGGTTACTGCCTCTGNOTE. Primers used for the ligation assay and BEAMing are provided in Wu et al.4Jones S. et al.Science. 2008; 321: 1801-1806Crossref PubMed Scopus (3043) Google ScholarHRM, high-resolution melt curve assay. Open table in a new tab WT, wild-type. NOTE. The mean PanIN concentrations of mutant KRAS increased with increasing grade of PanINs in each type of mutation. SD, standard deviation. NOTE. Combining this set with the first set of PanIN results, GNAS mutations were still more common in patients with a primary diagnosis other than pancreatic cancer (P = .02). NOTE. Primers used for the ligation assay and BEAMing are provided in Wu et al.4Jones S. et al.Science. 2008; 321: 1801-1806Crossref PubMed Scopus (3043) Google Scholar HRM, high-resolution melt curve assay.

The earlier diagnosis of cancer is one of the keys to reducing cancer deaths in the future. Here we describe our efforts to develop a noninvasive blood test for the detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. We combined blood tests for KRAS gene mutations with carefully thresholded protein biomarkers to determine whether the combination of these markers was superior to any single marker. The cohort tested included 221 patients with resectable pancreatic ductal adenocarcinomas and 182 control patients without known cancer. KRAS mutations were detected in the plasma of 66 patients (30%), and every mutation found in the plasma was identical to that subsequently found in the patient's primary tumor (100% concordance). The use of KRAS in conjunction with four thresholded protein biomarkers increased the sensitivity to 64%. Only one of the 182 plasma samples from the control cohort was positive for any of the DNA or protein biomarkers (99.5% specificity). This combinatorial approach may prove useful for the earlier detection of many cancer types.

Approximately 10% to 15% of human cancers lack detectable telomerase activity, and a subset of these maintain telomere lengths by the telomerase-independent telomere maintenance mechanism termed alternative lengthening of telomeres (ALT). The ALT phenotype, relatively common in subtypes of sarcomas and astrocytomas, has rarely been reported in epithelial malignancies. However, the prevalence of ALT has not been thoroughly assessed across all cancer types. We therefore comprehensively surveyed the ALT phenotype in a broad range of human cancers. In total, two independent sets comprising 6110 primary tumors from 94 different cancer subtypes, 541 benign neoplasms, and 264 normal tissue samples were assessed by combined telomere-specific fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence labeling for PML protein. Overall, ALT was observed in 3.73% (228/6110) of all tumor specimens, but was not observed in benign neoplasms or normal tissues. This is the first report of ALT in carcinomas arising from the bladder, cervix, endometrium, esophagus, gallbladder, kidney, liver, and lung. Additionally, this is the first report of ALT in medulloblastomas, oligodendrogliomas, meningiomas, schwannomas, and pediatric glioblastoma multiformes. Previous studies have shown associations between ALT status and prognosis in some tumor types; thus, further studies are warranted to assess the potential prognostic significance and unique biology of ALT-positive tumors. These findings may have therapeutic consequences, because ALT-positive cancers are predicted to be resistant to anti-telomerase therapies. Approximately 10% to 15% of human cancers lack detectable telomerase activity, and a subset of these maintain telomere lengths by the telomerase-independent telomere maintenance mechanism termed alternative lengthening of telomeres (ALT). The ALT phenotype, relatively common in subtypes of sarcomas and astrocytomas, has rarely been reported in epithelial malignancies. However, the prevalence of ALT has not been thoroughly assessed across all cancer types. We therefore comprehensively surveyed the ALT phenotype in a broad range of human cancers. In total, two independent sets comprising 6110 primary tumors from 94 different cancer subtypes, 541 benign neoplasms, and 264 normal tissue samples were assessed by combined telomere-specific fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence labeling for PML protein. Overall, ALT was observed in 3.73% (228/6110) of all tumor specimens, but was not observed in benign neoplasms or normal tissues. This is the first report of ALT in carcinomas arising from the bladder, cervix, endometrium, esophagus, gallbladder, kidney, liver, and lung. Additionally, this is the first report of ALT in medulloblastomas, oligodendrogliomas, meningiomas, schwannomas, and pediatric glioblastoma multiformes. Previous studies have shown associations between ALT status and prognosis in some tumor types; thus, further studies are warranted to assess the potential prognostic significance and unique biology of ALT-positive tumors. These findings may have therapeutic consequences, because ALT-positive cancers are predicted to be resistant to anti-telomerase therapies. Telomeres are the nucleoprotein complexes located at the extreme ends of eukaryotic chromosomes; they consist of 5 to 10 kb of the repeating hexanucleotide DNA sequence TTAGGG.1Blackburn E.H. Structure and function of telomeres.Nature. 1991; 350: 569-573Crossref PubMed Scopus (3060) Google Scholar, 2Moyzis R.K. Buckingham J.M. Cram L.S. Dani M. Deaven L.L. Jones M.D. Meyne J. Ratliff R.L. Wu J.R. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes.Proc Natl Acad Sci USA. 1988; 85: 6622-6626Crossref PubMed Scopus (1867) Google Scholar The shelterin complex, a core set of six proteins integral for telomere function, associates with these repetitive DNA regions.3Palm W. de Lange T. How shelterin protects mammalian telomeres.Annu Rev Genet. 2008; 42: 301-334Crossref PubMed Scopus (1384) Google Scholar, 4de Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres.Genes Dev. 2005; 19: 2100-2110Crossref PubMed Scopus (2271) Google Scholar Telomeres function primarily to mask double-strand break DNA damage signals at chromosomal termini, inhibit terminal exonucleolytic degradation, and prevent chromosomal fusions.5de Lange T. How telomeres solve the end-protection problem.Science. 2009; 326: 948-952Crossref PubMed Scopus (613) Google Scholar, 6O'Sullivan R.J. Karlseder J. Telomeres: protecting chromosomes against genome instability.Nat Rev Mol Cell Biol. 2010; 11: 171-181Crossref PubMed Google Scholar In normal somatic cells, telomeres shorten with each cell division, and significant telomere shortening leads to p53-dependent senescence or apoptosis.7Vaziri H. Critical telomere shortening regulated by the ataxia-telangiectasia gene acts as a DNA damage signal leading to activation of p53 protein and limited life-span of human diploid fibroblasts A review.Biochemistry (Mosc). 1997; 62: 1306-1310PubMed Google Scholar As a result, there is a limited number of population doublings that a somatic cell lineage may undergo, at which point further proliferative expansion is blocked. During malignant transformation, these cell cycle checkpoints are abrogated (eg, through mutations in tumor suppressor proteins). If cellular proliferation continues unchecked, then genomic instability may ensue via chromosomal breakage-fusion-bridge cycles caused by eroded, dysfunctional telomeres.8Maser R.S. DePinho R.A. Connecting chromosomes, crisis, and cancer.Science. 2002; 297: 565-569Crossref PubMed Scopus (485) Google Scholar In 85% to 90% of human cancers, telomere dysfunction is attenuated and telomere length appears to be maintained, or increased, through up-regulation of the enzyme telomerase, a reverse transcriptase with the ability to synthesize new telomere DNA using an internal RNA template.9Shay J.W. Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer. 1997; 33: 787-791Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2389) Google Scholar However, telomere loss may also be compensated in some cancers by the telomerase-independent telomere maintenance mechanism termed alternative lengthening of telomeres (ALT), which is thought to be dependent on homologous recombination.10Bryan T.M. Englezou A. Dalla-Pozza L. Dunham M.A. Reddel R.R. Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines.Nat Med. 1997; 3: 1271-1274Crossref PubMed Scopus (1026) Google Scholar The ALT phenotype is identified at the cellular level by the presence of ALT-associated promyelocytic leukemia (PML) protein nuclear bodies (APBs) that contain large amounts of telomeric DNA, in addition to PML protein and other proteins involved in telomere binding, DNA replication, and recombination.11Royle N.J. Foxon J. Jeyapalan J.N. Mendez-Bermudez A. Novo C.L. Williams J. Cotton V.E. Telomere length maintenance–an ALTernative mechanism.Cytogenet Genome Res. 2008; 122: 281-291Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar, 12Cesare A.J. Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications.Nat Rev Genet. 2010; 11: 319-330Crossref PubMed Scopus (673) Google Scholar ALT-positive cells are characterized by striking telomere length heterogeneity, as well as increased chromosomal instability. APBs are cancer-specific and, in fixed tissues, can be visualized by combined telomere-specific fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence labeling for PML protein.13Meeker A.K. Gage W.R. Hicks J.L. Simon I. Coffman J.R. Platz E.A. March G.E. De Marzo A.M. Telomere length assessment in human archival tissues: combined telomere fluorescence in situ hybridization and immunostaining.Am J Pathol. 2002; 160: 1259-1268Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (180) Google Scholar, 14Montgomery E. Argani P. Hicks J.L. DeMarzo A.M. Meeker A.K. Telomere lengths of translocation-associated and nontranslocation-associated sarcomas differ dramatically.Am J Pathol. 2004; 164: 1523-1529Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (75) Google Scholar This method has been extensively validated and allows for straightforward identification of ALT-positive cancers in fixed human tissue specimens.15Henson J.D. Hannay J.A. McCarthy S.W. Royds J.A. Yeager T.R. Robinson R.A. Wharton S.B. Jellinek D.A. Arbuckle S.M. Yoo J. Robinson B.G. Learoyd D.L. Stalley P.D. Bonar S.F. Yu D. Pollock R.E. Reddel R.R. A robust assay for alternative lengthening of telomeres in tumors shows the significance of alternative lengthening of telomeres in sarcomas and astrocytomas.Clin Cancer Res. 2005; 11: 217-225PubMed Google Scholar The ALT phenotype is common among certain sarcomas (eg, osteosarcomas and liposarcomas), as well as in subsets of central nervous system tumors, including astrocytomas16Henson J.D. Reddel R.R. Assaying and investigating Alternative Lengthening of Telomeres activity in human cells and cancers.FEBS Lett. 2010; 584: 3800-3811Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (177) Google Scholar; however, the prevalence of ALT varies widely among these different tumor types. Our laboratory recently reported the presence of ALT in a small subset of breast carcinomas,17Subhawong A.P. Heaphy C.M. Argani P. Konishi Y. Kouprina N. Nassar H. Vang R. Meeker A.K. The alternative lengthening of telomeres phenotype in breast carcinoma is associated with HER-2 overexpression.Mod Pathol. 2009; 22: 1423-1431Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar but the ALT phenotype has rarely been reported in other epithelial malignancies.16Henson J.D. Reddel R.R. Assaying and investigating Alternative Lengthening of Telomeres activity in human cells and cancers.FEBS Lett. 2010; 584: 3800-3811Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (177) Google Scholar We have comprehensively surveyed the ALT phenotype in two independent sets of fixed specimens, comprising a total of 6110 primary tumors from a broad range of human cancer subtypes. Overall, the prevalence of the ALT phenotype is 3.73%; however, the prevalence varies drastically between different subtypes. Here, we describe the results of this extensive survey, including the novel finding of the ALT phenotype in carcinomas arising from the bladder, cervix, endometrium, esophagus, gallbladder, kidney, liver, and lung. In addition, this is the first report of the ALT phenotype in several tumor types of nonepithelial origin, including medulloblastomas, pediatric glioblastomas multiformes (GBMs), oligodendrogliomas, meningiomas, and schwannomas. Two independent sets of primary tumor tissues were used in the present study. Set 1 consisted of 4001 tumors from 68 different cancer subtypes. The vast majority of these cases were resected and processed at the Johns Hopkins Hospital and were arrayed in tissue microarray (TMA) format. This set consisted of 165 TMAs containing multiple cores of each tumor specimen and, in most instances, adjacent normal tissue. In addition to these TMAs from our institution, seven TMAs containing 195 cases (three cores per case from cancer and one core from matched normal intestinal mucosa) of primary small intestinal adenocarcinoma from 20 institutions of the Korean Small Intestinal Cancer Study Group were included. Moreover, 56 invasive breast carcinoma tissue sections from the Johns Hopkins Hospital and 29 neuroblastic tumor tissue sections from the University of Texas Southwestern Medical Center were also obtained. To validate and expand on the findings in this first set, a second set of multitumor arrays was obtained (set 2).18Baumhoer D. Tornillo L. Stadlmann S. Roncalli M. Diamantis E.K. Terracciano L.M. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.Am J Clin Pathol. 2008; 129: 899-906Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar TMAs in set 2 contained 2109 primary tumors from 61 cancer subtypes. In this set of tumors, each case was represented on the array by a single tissue core. In addition to the malignant tumors, 541 benign neoplasms (see Supplemental Table S1 at http://ajp.amjpathol.org) and 264 normal tissue samples (see Supplemental Table S2 at http://ajp.amjpathol.org) were also obtained. The study was approved by the Johns Hopkins University School of Medicine institutional review board. Combined telomere-specific FISH and immunofluorescence labeling of PML protein was performed as described previously.13Meeker A.K. Gage W.R. Hicks J.L. Simon I. Coffman J.R. Platz E.A. March G.E. De Marzo A.M. Telomere length assessment in human archival tissues: combined telomere fluorescence in situ hybridization and immunostaining.Am J Pathol. 2002; 160: 1259-1268Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (180) Google Scholar, 14Montgomery E. Argani P. Hicks J.L. DeMarzo A.M. Meeker A.K. Telomere lengths of translocation-associated and nontranslocation-associated sarcomas differ dramatically.Am J Pathol. 2004; 164: 1523-1529Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (75) Google Scholar Briefly, deparaffinized slides were hydrated, steamed for 25 minutes in citrate buffer (Vector Laboratories, Burlingame, CA), dehydrated, and hybridized with a Cy3-labeled peptide nucleic acid (PNA) probe complementary to the mammalian telomere repeat sequence [(N-terminus to C-terminus) 5′-CCCTAACCCTAACCCTAA-3′]. As a positive control for hybridization efficiency, an Invitrogen (Carlsbad, CA) Alexa Fluor 610-labeled PNA probe having specificity for human centromeric DNA repeats (5′-ATTCGTTGGAAACGGGA-3′, CENP-B binding sequence) was included in the hybridization solution.19Chen C. Hong Y.K. Ontiveros S.D. Egholm M. Strauss W.M. Single base discrimination of CENP-B repeats on mouse and human chromosomes with PNA-FISH.Mamm Genome. 1999; 10: 13-18Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar After posthybridization washes, an anti-PML antibody (1:100 dilution; catalog no. PG-M3; Dako, Carpinteria, CA) was incubated for 45 minutes at room temperature, followed by incubation of anti-mouse Alexa Fluor 488 fluorescent secondary antibody (catalog no. A-11001; Molecular Probes, Eugene, OR) and counterstaining with DAPI. Slides were imaged with a Nikon 50i epifluorescence microscope equipped with X-Cite series 120 illuminator (EXFO Photonics Solutions, Mississauga, ON, Canada) and appropriate fluorescence excitation/emission filters. Grayscale images were captured using Nikon NIS-Elements software version 2.30 and an attached Photometrics (Tucson, AZ) CoolSNAP EZ digital camera, pseudo-colored, and merged. All cases were assessed for the presence of the ALT phenotype. ALT-positive cases were identified by large, very bright intranuclear foci of telomere FISH signals marking ALT-associated telomeric foci throughout the tumor cells. Although telomere FISH signals from these individual bright foci often colocalized with PML protein, heterogeneity in this trait was observed, even within the same tumor. Given several instances in the literature of ALT-positive cell lines lacking telomere/PML colocalization,20Cerone M.A. Autexier C. Londoño-Vallejo J.A. Bacchetti S. A human cell line that maintains telomeres in the absence of telomerase and of key markers of ALT.Oncogene. 2005; 24: 7893-7901Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar, 21Fasching C.L. Bower K. Reddel R.R. Telomerase-independent telomere length maintenance in the absence of alternative lengthening of telomeres-associated promyelocytic leukemia bodies.Cancer Res. 2005; 65: 2722-2729Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 22Marciniak R.A. Cavazos D. Montellano R. Chen Q. Guarente L. Johnson F.B. A novel telomere structure in a human alternative lengthening of telomeres cell line.Cancer Res. 2005; 65: 2730-2737Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar colocalization was not considered an absolute requirement for classifying a case as ALT-positive. Thus, cases were classified as ALT-positive if they met the following criteria: first, the presence of ultra-bright intranuclear foci of telomere FISH signals (ALT-associated telomeric foci), with integrated total signal intensities for individual foci being >10-fold that of the per cell mean integrated signal intensities for all telomeric signals in individual benign stromal cells within the same case; second, ≥1% of tumor cells displaying these ALT-associated telomeric foci. Cases lacking ALT-associated telomeric foci in which at least 500 cells were assessed were considered ALT-negative. Areas exhibiting necrosis were excluded from consideration. When appropriate, different tumor subtypes were compared with a two-sided Fisher's exact test using SAS version 9.2 statistical packages (SAS Institute, Cary, NC). P values of <0.05 were considered to be significant. We identified the presence of the ALT phenotype by using telomere-specific FISH to visualize telomeric DNA in interphase nuclei of fixed tissue specimens. ALT-positive tumors are readily distinguishable by large ultra-bright telomere FISH signals, which are a nearly universal feature of ALT-positive cell populations.23Yeager T.R. Neumann A.A. Englezou A. Huschtscha L.I. Noble J.R. Reddel R.R. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.Cancer Res. 1999; 59: 4175-4179PubMed Google Scholar In Figure 1, we present for comparison an ALT-negative invasive urothelial carcinoma case (Figure 1A) and an ALT-positive invasive urothelial carcinoma case (Figure 1B). The ALT-negative case displays robust telomere signals in the tumor cells and adjacent stromal cells; in the ALT-positive case, distinctive large, very bright intranuclear foci of telomere FISH signals mark ALT-associated telomeric foci throughout the tumor cells. Other representative ALT-positive cases shown include a renal sarcomatoid carcinoma (Figure 1C) and an anaplastic medulloblastoma (Figure 1D), neither of which has been previously identified as using the ALT pathway. In ALT-positive tumors, the percentage of cells containing ALT-associated telomeric foci varied by tumor type, ranging from 1% to >95% of tumor cells. This trait also varied among different tumors from the same cancer subtype. Finally, in Figure 1 we present two additional ALT-positive cases, an oligodendroglioma (Figure 1E) and an angiosarcoma (Figure 1F). In both of these cases, PML protein colocalizes to most of the ALT-associated telomere foci. The inset for each case highlights a typical APB, displaying a targetoid appearance of telomere DNA signal with a peripheral rim of PML protein. To determine the prevalence of the ALT phenotype in human cancers, we assessed two independent sets of malignant tissues comprising 6110 primary tumors from 94 different cancer subtypes. Set 1 consisted of 4001 specimens encompassing a broad range of malignant tumors, including tumors arising from the adrenal gland, biliary tract, breast, central nervous system, colon, esophagus, gallbladder, kidney, liver, lung, ovary, pancreas, prostate, salivary gland, skin, small intestine, soft tissue, stomach, urinary bladder, and uterus (Table 1). A total of 141 tumors were identified as ALT-positive in set 1, yielding a prevalence of 3.52%. To confirm and expand on these findings, we further assessed the ALT phenotype in a second set of multitumor TMAs (set 2), which had previously been used to validate other molecular markers.18Baumhoer D. Tornillo L. Stadlmann S. Roncalli M. Diamantis E.K. Terracciano L.M. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.Am J Clin Pathol. 2008; 129: 899-906Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar This set of tumors consisted of 2109 primary tumor specimens from 61 different cancer subtypes. Set 2 included types similar to the first set, but also included hematopoietic and neuroendocrine neoplasms, as well as tumors arising from the oral cavity, pleura, tendon sheath, testis, and thyroid (Table 1). A total of 87 tumors were identified as ALT-positive in set 2, representing a prevalence of 4.13%. With cases from both sets combined, a total of 228 ALT-positive tumors were identified, representing an overall prevalence of the ALT phenotype in human cancers of 3.73% (Table 1).Table 1Prevalence of the ALT Phenotype in Human Cancer SubtypesLocation/Tumor typeALT+, set 1ALT+, set 2ALT+, overalln/N%n/N%n/N%Adrenal gland/peripheral nervous system Pheochromocytoma1/3931/2842/673 Neuroblastoma2/229—⁎Subtype not included in this set.—2/229 Ganglioneuroblastoma1/714——1/714Biliary Cholangiocarcinoma, extrahepatic0/230——0/230 Cholangiocarcinoma, intrahepatic0/100——0/100Breast Ductal carcinoma†Includes data from samples previously published.175/21720/3405/2512 Ductal carcinoma with lobular features0/200——0/200 Lobular carcinoma1/1470/1301/274 Mucinous carcinoma——0/1500/150 Tubular carcinoma——0/900/90 Medullary carcinoma0/101/5421/552Central nervous system Pilocytic astrocytoma (grade 1)2/5540/302/583 Diffuse astrocytoma (grade 2)14/19743/83817/2763 Anaplastic astrocytoma (grade 3)17/19892/111819/3063 Glioblastoma multiforme (grade 4; adult)9/65143/40812/10511 Glioblastoma multiforme (grade 4; pediatric)14/3244——14/3244 Oligodendroglioma6/20302/20108/4020 Medulloblastoma, anaplastic3/1718——3/1718 Medulloblastoma, nonanaplastic1/383——1/383 Other embryonal tumors1/1010——1/1010 Meningioma——1/4621/462 Schwannoma——1/4421/442Colon Adenocarcinoma0/7700/4900/1260Esophagus Adenocarcinoma0/9701/9111/1061 Squamous cell carcinoma——0/2900/290 Small cell carcinoma——0/100/10Gallbladder Adenocarcinoma1/2740/3301/602Hematopoietic neoplasms non-Hodgkin's lymphoma, other subtypes——0/5400/540 non-Hodgkin's lymphoma, diffuse large B-cell——0/1000/100 Hodgkin's lymphoma, nodular sclerosis——0/2300/230 Hodgkin's lymphoma, mixed cellularity——0/1700/170 Thymoma——0/3700/370Kidney Clear cell carcinoma1/6910/4801/1171 Papillary carcinoma0/5401/3231/861 Chromophobe carcinoma3/3781/10104/479 Sarcomatoid carcinoma2/277——2/277Larynx Squamous cell carcinoma——0/2900/290Liver Hepatocellular carcinoma7/9181/3038/1217Lung Adenocarcinoma0/6400/8900/1530 Squamous cell carcinoma0/5500/4500/1000 Papillary carcinoma0/450——0/450 Bronchioloalveolar carcinoma0/400——0/400 Small cell carcinoma0/1601/4721/632 Large cell carcinoma0/1001/2541/353 Carcinoma, other subtypes0/150——0/150 Carcinoid tumor0/30——0/30Neuroendocrine neoplasms Carcinoid tumor——2/3262/326 Paraganglioma——1/8131/813Oral cavity Squamous cell carcinoma——0/4100/410Ovary Serous carcinoma0/16300/4200/2050 Clear cell carcinoma2/564——2/564 Endometrioid carcinoma0/3201/4031/721 Mucinous carcinoma——0/2100/210Pancreas Adenocarcinoma0/42000/2800/4480Pleura Malignant mesothelioma——1/2841/284Prostate Adenocarcinoma0/107100/8100/11520 Small cell carcinoma0/240——0/240Salivary gland Carcinoma0/980——0/980Skin Malignant melanoma2/4745/5987/1067 Basal cell carcinoma——0/5700/570 Squamous cell carcinoma——0/5600/560Small intestine Adenocarcinoma0/19500/2000/2150Soft tissues Gastrointestinal stromal tumor0/340——0/340 Kaposi's sarcoma0/3300/2200/550 Ewing's sarcoma/primitive neuroectodermal tumor0/230——0/230 Undifferentiated pleomorphic sarcoma‡Includes cases classified as malignant fibrous histiocytoma.15/226818/306033/5263 Fibrosarcoma and variants3/2114——3/2114 Leiomyosarcoma11/138520/464331/5953 Liposarcoma3/10306/28219/3824 Angiosarcoma1/911——1/911 Epithelioid sarcoma2/633——2/633 Clear cell sarcoma0/50——0/50 Malignant peripheral nerve sheath tumor0/40——0/40 Rhabdomyosarcoma0/40——0/40 Chondrosarcoma2/2100——2/2100 Neurofibroma——4/37114/3711Stomach Adenocarcinoma0/8000/7500/1550Tendon sheath Giant cell tumor——0/2200/220Testis Seminoma——0/4800/480 Nonseminomatous germ cell tumor——7/46157/4615Thyroid Follicular carcinoma——0/5200/520 Papillary carcinoma——0/3000/300Urinary bladder Invasive urothelial carcinoma2/7530/7502/1501 Non-invasive urothelial carcinoma——0/3800/380 Small cell carcinoma3/1323——3/1323 Non-invasive papillary urothelial carcinoma0/50——0/50 Squamous carcinoma0/20——0/20 Sarcomatoid carcinoma0/10——0/10Uterus Cervix, squamous carcinoma3/12720/2503/1522 Cervix, adenocarcinoma0/190——0/190 Endometrium, endometrioid carcinoma0/1600/4800/640 Endometrium, serous carcinoma1/9112/3263/417 Endometrium, mixed mesodermal tumor0/40——0/40 Endometrium, clear cell carcinoma0/30——0/30 Subtype not included in this set.† Includes data from samples previously published.17Subhawong A.P. Heaphy C.M. Argani P. Konishi Y. Kouprina N. Nassar H. Vang R. Meeker A.K. The alternative lengthening of telomeres phenotype in breast carcinoma is associated with HER-2 overexpression.Mod Pathol. 2009; 22: 1423-1431Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar‡ Includes cases classified as malignant fibrous histiocytoma. Open table in a new tab Although we recently described the presence of the ALT phenotype in a small subset of breast carcinomas,17Subhawong A.P. Heaphy C.M. Argani P. Konishi Y. Kouprina N. Nassar H. Vang R. Meeker A.K. The alternative lengthening of telomeres phenotype in breast carcinoma is associated with HER-2 overexpression.Mod Pathol. 2009; 22: 1423-1431Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar the ALT phenotype has rarely been reported in other epithelial malignancies.16Henson J.D. Reddel R.R. Assaying and investigating Alternative Lengthening of Telomeres activity in human cells and cancers.FEBS Lett. 2010; 584: 3800-3811Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (177) Google Scholar Here, we report the presence of the ALT phenotype in numerous epithelial malignancies. The ALT phenotype was present in 8/121 (7%) cases of hepatocellular carcinoma, 3/41 (7%) cases of serous endometrial carcinoma, 3/152 (2%) cases of squamous cervical carcinoma, 1/60 (2%) case of gallbladder adenocarcinoma, and 1/106 (1%) case of esophageal adenocarcinoma. In renal carcinoma, the ALT phenotype was observed in 4/47 (9%) cases of chromophobe carcinoma, 2/27 (7%) cases of sarcomatoid carcinoma, 1/117 (1%) case of clear cell carcinoma, and 1/86 (1%) case of papillary carcinoma. In urinary bladder carcinomas, we observed the presence of ALT in 3/13 (7%) cases of small cell bladder carcinoma and 2/150 (1%) cases of invasive urothelial carcinoma. Although ALT was not observed in most lung carcinoma subtypes, we did observe a single case each of large cell [1/35 (3%)] and small cell [1/63 (2%)] carcinomas that exhibited the ALT phenotype. In addition to the novel findings in epithelial malignancies, we present here the first report of ALT in several tumor types of nonepithelial origin, including medulloblastomas, pediatric GBMs, oligodendrogliomas, meningiomas, and schwannomas. In medulloblastomas, the prevalence of ALT-positive tumors varied across subtypes: 18% in anaplastic medulloblastomas and 3% in nonanaplastic medulloblastomas. The prevalence of the ALT phenotype in adult GBM cases was 11%. We also assessed 32 cases of pediatric GBM and observed a statistically significant increase in the prevalence of the ALT phenotype in the pediatric cases (44%), compared with the adult cases (P = 0.0002). In other central nervous system tumors, the prevalence of ALT was 20% in oligodendrogliomas, 2% in meningiomas, and 2% in schwannomas. There appear to be several cancer subtypes that rarely, if ever, use the ALT telomere maintenance mechanism. In particular, we did not observe the ALT phenotype in adenocarcinomas arising from the prostate (N = 1152), pancreas (N = 448), small intestine (N = 215), stomach (N = 155), or colon (N = 126). Although the numbers of cases were smaller, we also did not observe the ALT phenotype in cholangiocarcinomas, laryngeal squamous cell carcinomas, oral squamous cell carcinomas, salivary gland carcinomas, follicular and papillary thyroid carcinomas, giant cell tumors of the tendon sheath, or hematopoietic neoplasms. Although malignancies arising from certain organs (eg, prostate cancer) rarely, if ever, develop ALT, there are malignancies from other organ sites that are capable of developing the ALT phenotype, but apparently only in particular cancer subtypes. Notably, in lung carcinoma, the ALT phenotype was observed only in a small subset of carcinomas originating from neuroendocrine cells; it was not observed in any other subtype. Other specific subtypes in which we did not observe the ALT phenotype include ovarian serous carcinoma, endometrioid carcinoma of the endometrium, seminoma, and basal cell and squamous cell carcinoma of the skin. Although the ALT phenotype is highly prevalent in certain types of sarcomas, we did not find evidence of the ALT phenotype in gastrointestinal stromal tumors, Kaposi's sarcomas, or Ewing's sarcomas/primitive neuroectodermal tumors. Next, we assessed a set of 264 normal tissues encompassing a wide range of tissue types. The ALT phenotype was not observed in these non-neoplastic tissue samples (see Supplemental Table S1 at http://ajp.amjpathol.org). In accord with this observation, we did not observe the ALT phenotype in non-neoplastic tissue entrapped in or adjacent to any of the tumors assessed. We also assessed a set of 541 benign neoplasms arising from a range of different tissues. The ALT phenotype was not observed in these benign neoplasms (see Supplemental Table S1 at http://ajp.amjpathol.org). Although we did not specifically assess intraepithelial neoplasms, we did observe the ALT phenotype in two individual cases: a melanoma in situ and a case of cervical intraepithelial neoplasia (grade 3). For representative images demonstrating the presence of ALT-associated telomeric foci in these cases (see Supplemental Figure S1 at http://ajp.amjpathol.org). In the present study, we comprehensively surveyed the A

BackgroundSpecific populations of highly tumorigenic cells are thought to exist in many human tumors, including pancreatic adenocarcinoma. However, the clinical significance of these tumor-initiating (ie, cancer stem) cells remains unclear. Aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity can identify tumor-initiating cells and normal stem cells from several human tissues. We examined the prognostic significance and functional features of ALDH expression in pancreatic adenocarcinoma.

Background & AimsThe management of pancreatic cysts poses challenges to both patients and their physicians. We investigated whether a combination of molecular markers and clinical information could improve the classification of pancreatic cysts and management of patients.MethodsWe performed a multi-center, retrospective study of 130 patients with resected pancreatic cystic neoplasms (12 serous cystadenomas, 10 solid pseudopapillary neoplasms, 12 mucinous cystic neoplasms, and 96 intraductal papillary mucinous neoplasms). Cyst fluid was analyzed to identify subtle mutations in genes known to be mutated in pancreatic cysts (BRAF, CDKN2A, CTNNB1, GNAS, KRAS, NRAS, PIK3CA, RNF43, SMAD4, TP53, and VHL); to identify loss of heterozygozity at CDKN2A, RNF43, SMAD4, TP53, and VHL tumor suppressor loci; and to identify aneuploidy. The analyses were performed using specialized technologies for implementing and interpreting massively parallel sequencing data acquisition. An algorithm was used to select markers that could classify cyst type and grade. The accuracy of the molecular markers was compared with that of clinical markers and a combination of molecular and clinical markers.ResultsWe identified molecular markers and clinical features that classified cyst type with 90%−100% sensitivity and 92%−98% specificity. The molecular marker panel correctly identified 67 of the 74 patients who did not require surgery and could, therefore, reduce the number of unnecessary operations by 91%.ConclusionsWe identified a panel of molecular markers and clinical features that show promise for the accurate classification of cystic neoplasms of the pancreas and identification of cysts that require surgery. The management of pancreatic cysts poses challenges to both patients and their physicians. We investigated whether a combination of molecular markers and clinical information could improve the classification of pancreatic cysts and management of patients. We performed a multi-center, retrospective study of 130 patients with resected pancreatic cystic neoplasms (12 serous cystadenomas, 10 solid pseudopapillary neoplasms, 12 mucinous cystic neoplasms, and 96 intraductal papillary mucinous neoplasms). Cyst fluid was analyzed to identify subtle mutations in genes known to be mutated in pancreatic cysts (BRAF, CDKN2A, CTNNB1, GNAS, KRAS, NRAS, PIK3CA, RNF43, SMAD4, TP53, and VHL); to identify loss of heterozygozity at CDKN2A, RNF43, SMAD4, TP53, and VHL tumor suppressor loci; and to identify aneuploidy. The analyses were performed using specialized technologies for implementing and interpreting massively parallel sequencing data acquisition. An algorithm was used to select markers that could classify cyst type and grade. The accuracy of the molecular markers was compared with that of clinical markers and a combination of molecular and clinical markers. We identified molecular markers and clinical features that classified cyst type with 90%−100% sensitivity and 92%−98% specificity. The molecular marker panel correctly identified 67 of the 74 patients who did not require surgery and could, therefore, reduce the number of unnecessary operations by 91%. We identified a panel of molecular markers and clinical features that show promise for the accurate classification of cystic neoplasms of the pancreas and identification of cysts that require surgery.

NUT midline carcinoma (NMC) is a uniformly lethal malignancy that is defined by rearrangement of the nuclear protein in testis (NUT) gene on chromosome 15q14. NMCs are morphologically indistinguishable from other poorly differentiated carcinomas, and the diagnosis is usually made currently by fluorescence in situ hybridization (FISH). As normal NUT expression is confined to testis and ovary, we reasoned that an immunohistochemical (IHC) stain for NUT would be useful in diagnosing NMC. To this end, we raised a highly specific rabbit monoclonal antibody, C52, against a recombinant NUT polypeptide, and developed an IHC staining protocol. The sensitivity and specificity of C52 staining was evaluated in a panel of 1068 tissues, predominantly diverse types of carcinomas (n=906), including 30 NMCs. Split-apart FISH for NUT rearrangement was used as a “gold standard” diagnostic test for NMC. C52 immunoreactivity among carcinomas was confined to NMCs. IHC staining had a sensitivity of 87%, a specificity of 100%, a negative predictive value of 99%, and a positive predictive value of 100%. Two new cases of NMC containing BRD4-NUT fusions were detected by C52 IHC, but missed by conventional FISH. In both instances, these tumors contained cryptic BRD4-NUT rearrangements, as confirmed by FISH using a refined set of probes. Some germ cell tumors, including 64% of dysgerminomas, showed weak NUT immunoreactivity, consistent with the expression of NUT in normal germ cells. We conclude that IHC staining with the C52 monoclonal antibody is a highly sensitive and specific test that reliably distinguishes NMC from other forms of carcinoma. The NUT antibody is being prepared for commercial release and will be available in the near future.

Hepatic resection is the most curative treatment option for early-stage hepatocellular carcinoma, but is associated with a high recurrence rate, which exceeds 50% at 5 years after surgery. Understanding the genetic basis of hepatocellular carcinoma at surgically curable stages may enable the identification of new molecular biomarkers that accurately identify patients in need of additional early therapeutic interventions. Whole exome sequencing and copy number analysis was performed on 231 hepatocellular carcinomas (72% with hepatitis B viral infection) that were classified as early-stage hepatocellular carcinomas, candidates for surgical resection. Recurrent mutations were validated by Sanger sequencing. Unsupervised genomic analyses identified an association between specific genetic aberrations and postoperative clinical outcomes. Recurrent somatic mutations were identified in nine genes, including TP53, CTNNB1, AXIN1, RPS6KA3, and RB1. Recurrent homozygous deletions in FAM123A, RB1, and CDKN2A, and high-copy amplifications in MYC, RSPO2, CCND1, and FGF19 were detected. Pathway analyses of these genes revealed aberrations in the p53, Wnt, PIK3/Ras, cell cycle, and chromatin remodeling pathways. RB1 mutations were significantly associated with cancer-specific and recurrence-free survival after resection (multivariate P = 0.038 and P = 0.012, respectively). FGF19 amplifications, known to activate Wnt signaling, were mutually exclusive with CTNNB1 and AXIN1 mutations, and significantly associated with cirrhosis (P = 0.017). Conclusion: RB1 mutations can be used as a prognostic molecular biomarker for resectable hepatocellular carcinoma. Further study is required to investigate the potential role of FGF19 amplification in driving hepatocarcinogenesis in patients with liver cirrhosis and to investigate the potential of anti-FGF19 treatment in these patients. (Hepatology 2014;60:1971–1981)