Wastewater-based surveillance (WBS) is an important epidemiological and public health tool for tracking pathogens across the scale of a building, neighbourhood, city, or region. WBS gained widespread adoption globally during the SARS-CoV-2 pandemic for estimating community infection levels by qPCR. Sequencing pathogen genes or genomes from wastewater adds information about pathogen genetic diversity, which can be used to identify viral lineages (including variants of concern) that are circulating in a local population. Capturing the genetic diversity by WBS sequencing is not trivial, as wastewater samples often contain a diverse mixture of viral lineages with real mutations and sequencing errors, which must be deconvoluted computationally from short sequencing reads. In this study we assess nine different computational tools that have recently been developed to address this challenge. We simulated 100 wastewater sequence samples consisting of SARS-CoV-2 BA.1, BA.2, and Delta lineages, in various mixtures, as well as a Delta–Omicron recombinant and a synthetic ‘novel’ lineage. Most tools performed well in identifying the true lineages present and estimating their relative abundances and were generally robust to variation in sequencing depth and read length. While many tools identified lineages present down to 1 % frequency, results were more reliable above a 5 % threshold. The presence of an unknown synthetic lineage, which represents an unclassified SARS-CoV-2 lineage, increases the error in relative abundance estimates of other lineages, but the magnitude of this effect was small for most tools. The tools also varied in how they labelled novel synthetic lineages and recombinants. While our simulated dataset represents just one of many possible use cases for these methods, we hope it helps users understand potential sources of error or bias in wastewater sequencing analysis and to appreciate the commonalities and differences across methods.

Abstract Wastewater-based surveillance (WBS) is an important epidemiological and public health tool for tracking pathogens across the scale of a building, neighbourhood, city, or region. WBS gained widespread adoption globally during the SARS-CoV-2 pandemic for estimating community infection levels by qPCR. Sequencing pathogen genes or genomes from wastewater adds information about pathogen genetic diversity which can be used to identify viral lineages (including variants of concern) that are circulating in a local population. Capturing the genetic diversity by WBS sequencing is not trivial, as wastewater samples often contain a diverse mixture of viral lineages with real mutations and sequencing errors, which must be deconvoluted computationally from short sequencing reads. In this study we assess nine different computational tools that have recently been developed to address this challenge. We simulated 100 wastewater sequence samples consisting of SARS-CoV-2 BA.1, BA.2, and Delta lineages, in various mixtures, as well as a Delta-Omicron recombinant and a synthetic “novel” lineage. Most tools performed well in identifying the true lineages present and estimating their relative abundances, and were generally robust to variation in sequencing depth and read length. While many tools identified lineages present down to 1% frequency, results were more reliable above a 5% threshold. The presence of an unknown synthetic lineage, which represents an unclassified SARS-CoV-2 lineage, increases the error in relative abundance estimates of other lineages, but the magnitude of this effect was small for most tools. The tools also varied in how they labelled novel synthetic lineages and recombinants. While our simulated dataset represents just one of many possible use cases for these methods, we hope it helps users understand potential sources of noise or bias in wastewater sequencing data and to appreciate the commonalities and differences across methods.

1.1. Abstract The human gut is a dense microbial community, of which bacteria and bacteriophages are the majority. Bacteriophages, viruses of bacteria, exist stably, without major fluctuations in the gut of healthy individuals. This stability appears to be due to an absence of ‘kill-the-winner’ dynamics, and the existence of ‘piggy-back-the-winner’ dynamics, where lysogenic replication rather than lytic replication occurs. Revisiting the deep-viral sequencing data of a healthy individual studied over 2.4 years, we were able to improve our understanding of how these dynamics occur in healthy individuals. We assembled prophages from bacterial metagenomic data and show that these prophages were continually switching from lysogenic to lytic replication. Prophages were the source of a stable extracellular phage population continually present in low abundance, in comparison to the lytic-phage population, where taxonomic diversity diverged over 2.4 years. The switch to lytic replication, or prophage induction, appears to occur mostly through spontaneous prophage induction. The observed phage dynamics of regular spontaneous induction are ecologically important as they allow prophages to maintain their ability to replicate, avoiding degradation and their loss from the gut microbiota. 1.2. Significance Statement It has been eight years since Minot and colleagues published their landmark longitudinal study of phages in the gut. In the years following, the bioinformatic field improved in great strides, including the methods of bacterial-genome assembly, phage-identification, and prophage detection. We leveraged the unprecedented deep sequencing of phages in this dataset by adding bacterial assembly and prophage detection analyzes. We show clearly for the first time that ‘piggy-back-the-winner’ dynamics are maintained in the gut through spontaneous prophage induction, and not widespread triggered prophage induction. These dynamics play an important ecological role by creating a stable subpopulation of phages, which could help explain how phages are maintained over the 2.4 years timeframe that this individual was studied.