Abstract Matriglycan is a linear polysaccharide of alternating xylose and glucuronate that binds extracellular matrix proteins and acts as a receptor for Lassa fever virus. LARGE1 synthesizes matriglycan on dystroglycan and mutations in LARGE1 cause muscular dystrophy with abnormal brain development. However, the mechanism of matriglycan polymerization by LARGE1 is unknown. Here, we report the cryo-EM structure of LARGE1. We show that LARGE1 functions as a dimer to polymerize matriglycan by alternating activities between the xylose transferase domain on one protomer and the glucuronate transferase domain on the other protomer. Biochemical analyses using a recombinant Golgi form of dystroglycan reveal that LARGE1 polymerizes matriglycan processively. Our results provide mechanistic insights into LARGE1 function and may facilitate novel therapeutic strategies for treating neuromuscular disorders or arenaviral infections. One-Sentence Summary Dimeric LARGE1 processively polymerizes matriglycan on dystroglycan using orthogonal active sites on alternate protomers.

Matriglycan (-1,3-β-glucuronic acid-1,3-α-xylose-) is a polysaccharide that is synthesized on α-dystroglycan, where it functions as a high-affinity glycan receptor for extracellular proteins, such as laminin, perlecan and agrin, thus anchoring the plasma membrane to the extracellular matrix. This biological activity is closely associated with the size of matriglycan. Using high-resolution mass spectrometry and site-specific mutant mice, we show for the first time that matriglycan on the T317/T319 and T379 sites of α-dystroglycan are not identical. T379-linked matriglycan is shorter than the previously characterized T317/T319-linked matriglycan, although it maintains its laminin binding capacity. Transgenic mice with only the shorter T379-linked matriglycan exhibited mild embryonic lethality, but those that survived were healthy. The shorter T379-linked matriglycan exists in multiple tissues and maintains neuromuscular function in adult mice. In addition, the genetic transfer of α-dystroglycan carrying just the short matriglycan restored grip strength and protected skeletal muscle from eccentric contraction-induced damage in muscle-specific dystroglycan knock-out mice. Due to the effects that matriglycan imparts on the extracellular proteome and its ability to modulate cell-matrix interactions, our work suggests that differential regulation of matriglycan length in various tissues optimizes the extracellular environment for unique cell types.

Protein O-Mannose Kinase (POMK) is a novel muscular dystrophy gene that phosphorylates mannose of core M3 (GalNac-β1,3-GlcNac-β1,4-Man) on α-dystroglycan (α-DG). Like-acetylglucosaminyltransferase-1 (LARGE) synthesizes matriglycan, a heteropolysaccharide [-GlcA-β1,3-Xyl-β1,3-]n, that enables α-DG to function as an extracellular matrix (ECM) receptor. Extension of matriglycan enhances its binding capacity for ECM ligands and is required for skeletal muscle function. However, the mechanisms which regulate LARGE-mediated extension of matriglycan during muscle differentiation are unknown. Here we show that LARGE initiates matriglycan synthesis on α-DG without POMK but requires POMK to extend matriglycan to its mature length. Furthermore, mouse and human skeletal muscle lacking POMK express a short, non-extended form of matriglycan and exhibit muscular dystrophy. Our results demonstrate a POMK-dependent mechanism that regulates matriglycan synthesis and α-DG receptor function.

Interpretation of disease-causing genetic variants remains a challenge in the field of human genetics and rare disease. Current costs and complexity of performing deep mutational scanning for charting variant effects hampers crowd-sourcing approaches toward genome-wide resolution of variants in all disease-related genes. Our framework, Saturation Mutagenesis-Reinforced Functional assays (SMuRF), addresses these issues by modularizing DMS components, offering simple and cost-effective saturation mutagenesis, as well as streamlining functional assays to enhance interpretation of unresolved variants. Applying SMuRF to neuromuscular disease genes FKRP and LARGE1, we have generated functional scores for over 99.8% of all possible coding single nucleotide variants (SNVs), providing an additional line of evidence for clinical variant interpretation in dystroglycanopathies. Data generated from SMuRF enables severity prediction, resolve critical protein structural regions susceptible to missense disruptions, and provide training datasets for development of computational predictors. In summary, our approach provides a framework for enabling variant-to-function insights for disease genes in a manner that is accessible for crowd-sourcing implementation across standard research laboratories.

Abstract Dystroglycan (DG) requires extensive post-translational processing to function as a receptor for extracellular matrix proteins containing laminin-G-like (LG) domains. Matriglycan is an elongated polysaccharide of alternating xylose and glucuronic acid that is uniquely synthesized on α-dystroglycan (α-DG) by like-acetylglucosaminyltransferase-1 (LARGE1) and binds with high affinity to matrix proteins like laminin. Defects in the post-translational processing of α-DG that result in a shorter form of matriglycan reduce the size of α-DG and decrease laminin binding, leading to various forms of muscular dystrophy. However, little is known regarding mechanisms that generate full-length matriglycan on α-DG (~150-250 kDa). Here, we show that LARGE1 can only synthesize a short, non-elongated form of matriglycan in mouse skeletal muscle that lacks the DG N-terminus (α-DGN), resulting in a ~100-125 kDa α-DG. This smaller form of α-DG binds laminin and maintains specific force but does not prevent muscle pathophysiology, including reduced force induced by eccentric contractions and abnormalities in neuromuscular junctions. Collectively, our study demonstrates that α-DGN is required for LARGE1 to extend matriglycan to its full mature length on α-DG and thus prevent muscle pathophysiology.