ABSTRACT Microcircuit function is determined by patterns of connectivity and short-term plasticity that vary with synapse type. Elucidating microcircuit function therefore requires synapse-specific investigation. The state of the art for synapse-specific measurements has long been paired recordings. Although powerful, this method is slow, leading to a throughput problem. To improve yield, we therefore created optomapping — an approximately 100-fold faster 2-photon optogenetic method — which we validated with paired-recording data. Using optomapping, we tested 15,433 candidate excitatory inputs to find 1,184 connections onto pyramidal, basket, and Martinotti cells in mouse primary visual cortex, V1. We measured connectivity, synaptic weight, and short-term dynamics across the V1 layers. We found log-normal synaptic strength distributions, even in individual inhibitory cells, which was previously not known. We reproduced the canonical circuit for pyramidal cells but found surprising and differential microcircuit structures, with excitation of basket cells concentrated to layer 5, and excitation of Martinotti cells dominating in layer 2/3. Excitation of inhibitory cells was denser, stronger, and farther-reaching than excitation of excitatory cells, which promotes stability and difference-of-Gaussian connectivity. We gathered an excitatory short-term plasticitome, which revealed that short-term plasticity is simultaneously target-cell specific and dependent on presynaptic cortical layer. Peak depolarization latency in pyramidal cells also emerged as more heterogeneous, suggesting heightened sensitivity to redistribution of synaptic efficacy. Optomapping additionally revealed high-order connectivity patterns including shared-input surplus for interconnected pyramidal cells in layer 6. Optomapping thus offered both resolution to the throughput problem and novel insights into the principles of neocortical excitatory fine structure. HIGHLIGHTS 2-photon optomapping of microcircuits is verified as fast, accurate, and reliable Synaptic weights distribute log-normally even for individual inhibitory neurons Maximal excitation of basket and Martinotti cells in layer 5 and 2/3, respectively Short-term plasticity depends on layer in addition to target cell

ABSTRACT Maintenance of cell integrity and cell-to-cell communication are fundamental biological processes. Filamentous fungi, such as Neurospora crassa , depend on communication to locate compatible cells, coordinate cell fusion, and establish a robust hyphal network. Two MAP-Kinase pathways are essential for communication and cell fusion in N. crassa ; the Cell Wall Integrity/MAK-1 pathway and the MAK-2 (signal response) pathway. Previous studies have demonstrated several points of cross talk between the MAK-1 and MAK-2 pathways, which is likely necessary for oordinating chemotropic growth toward an extracellular signal, and then mediating cell fusion. Canonical MAP-Kinase pathways begin with signal reception and end with a transcriptional response. Two transcription factors, ADV-1 and PP-1, are essential for communication and cell fusion. PP-1 is the conserved target of MAK-2, while it is unclear what targets ADV-1. We did RNAseq on Δadv-1, Δpp-1 , and wild-type cells and found that ADV-1 and PP-1 have a shared regulon including many genes required for communication, cell fusion, growth, development, and stress response. We identified ADV-1 and PP-1 binding sites across the genome by adapting the in vitro method of DNA-Affinity Purification sequencing (DAP-seq) for N. crassa . To elucidate the regulatory network, we misexpressed each transcription factor in each upstream MAPK deletion mutant. Misexpression of adv-1 was sufficient to fully suppress the phenotype of the Δpp-1 mutant and partially suppress the phenotype of the Δmak-1 mutant. Collectively, our data demonstrate that the MAK-1-ADV-1 and MAK-2- PP-1 pathways form a tight regulatory network that maintains cell integrity and mediates communication and cell fusion.

Accurate nutrient sensing is important for rapid fungal growth and exploitation of available resources. Sulfur is an important nutrient source found in a number of biological macromolecules, including proteins and lipids. The model filamentous fungus Neurospora crassa is capable of utilizing sulfur found in a variety of sources from amino acids to sulfate. During sulfur starvation, the transcription factor CYS-3 is responsible for upregulation of genes involved in sulfur uptake and assimilation. Using a combination of RNA sequencing and DNA affinity purification sequencing, we performed a global survey of the N. crassa sulfur starvation response and the role of CYS-3 in regulating sulfur responsive genes. Along with genes known to be involved in sulfur metabolism, the CYS-3 transcription factor also directly activated the expression of a number of uncharacterized transporter genes, suggesting that regulating sulfur import is an important aspect of regulation by CYS-3. Additionally, CYS-3 directly regulated the expression of genes involved in mitochondrial electron transfer. During sulfur starvation, genes involved in nitrogen metabolism, such as amino acid and nucleic acid metabolic pathways, along with genes encoding proteases and nucleases that are necessary for scavenging nitrogen, were activated. Sulfur starvation also caused changes in the expression of genes involved in carbohydrate metabolism, such as those encoding glycosyl hydrolases. Thus, our data suggest a connection between sulfur metabolism and other aspects of cellular metabolism.