Numerous chromatin regulators are required for embryonic stem (ES) cell self-renewal and pluripotency, but few have been studied in detail. Here, we examine the roles of several chromatin regulators whose loss affects the pluripotent state of ES cells. We find that Mbd3 and Brg1 antagonistically regulate a common set of genes by regulating promoter nucleosome occupancy. Furthermore, both Mbd3 and Brg1 play key roles in the biology of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC): Mbd3 colocalizes with Tet1 and 5hmC in vivo, Mbd3 knockdown preferentially affects expression of 5hmC-marked genes, Mbd3 localization is Tet1-dependent, and Mbd3 preferentially binds to 5hmC relative to 5-methylcytosine in vitro. Finally, both Mbd3 and Brg1 are themselves required for normal levels of 5hmC in vivo. Together, our results identify an effector for 5hmC, and reveal that control of gene expression by antagonistic chromatin regulators is a surprisingly common regulatory strategy in ES cells.

Proper regulation of chromatin structure is necessary for the maintenance of cell type-specific gene expression patterns. The embryonic stem cell (ESC) expression pattern governs self-renewal and pluripotency. Here, we present an RNAi screen in mouse ESCs of 1008 loci encoding chromatin proteins. We identified 68 proteins that exhibit diverse phenotypes upon knockdown (KD), including seven subunits of the Tip60-p400 complex. Phenotypic analyses revealed that Tip60-p400 is necessary to maintain characteristic features of ESCs. We show that p400 localization to the promoters of both silent and active genes is dependent upon histone H3 lysine 4 trimethylation (H3K4me3). Furthermore, the Tip60-p400 KD gene expression profile is enriched for developmental regulators and significantly overlaps with that of the transcription factor Nanog. Depletion of Nanog reduces p400 binding to target promoters without affecting H3K4me3 levels. Together, these data indicate that Tip60-p400 integrates signals from Nanog and H3K4me3 to regulate gene expression in ESCs.

ABSTRACT Mammalian sperm exhibit an unusual and heavily-compacted genomic packaging state. In addition to its role in organizing the compact and hydrodynamic sperm head, it has been proposed that sperm chromatin architecture helps to program gene expression in the early embryo. Scores of genome-wide surveys in sperm have reported patterns of chromatin accessibility, histone localization, histone modification, and chromosome folding. Here, we revisit these studies in light of recent reports that sperm obtained from the mouse epididymis are contaminated with low levels of cell-free chromatin. In the absence of proper sperm lysis we readily recapitulate multiple prominent genome-wide surveys of sperm chromatin, suggesting that these profiles primarily reflect contaminating cell-free chromatin. Removal of cell-free DNA, along with appropriate lysis conditions, are required to reveal a sperm chromatin state distinct from most previous reports. Using ATAC-Seq to explore relatively accessible genomic loci, we identify a landscape of open loci associated with early development and transcriptional control. Histone modification and chromosome folding studies also strongly support the hypothesis that prior studies suffer from contamination, but technical challenges associated with reliably preserving the architecture of the compacted sperm head prevent us from confidently assaying true localization patterns for these epigenetic marks. Together, our studies strongly argue that our knowledge of mammalian chromosome packaging remains largely incomplete, and motivate future efforts to more accurately characterize genome organization in mature sperm.

ABSTRACT Background The development of CRISPR genome editing has transformed biomedical research. Most applications reported thus far rely upon the Cas9 protein from Streptococcus pyogenes SF370 (SpyCas9). With many RNA guides, wild-type SpyCas9 can induce significant levels of unintended mutations at near-cognate sites, necessitating substantial efforts toward the development of strategies to minimize off-target activity. Although the genome-editing potential of thousands of other Cas9 orthologs remains largely untapped, it is not known how many will require similarly extensive engineering to achieve single-site accuracy within large (e.g. mammalian) genomes. In addition to its off-targeting propensity, SpyCas9 is encoded by a relatively large (~4.2 kb) open reading frame, limiting its utility in applications that require size-restricted delivery strategies such as adeno-associated virus vectors. In contrast, some genome-editing-validated Cas9 orthologs (e.g. from Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Geobacillus stearothermophilus and Neisseria meningitidis ) are considerably smaller and therefore better suited for viral delivery. Results Here we show that wild-type NmeCas9, when programmed with guide sequences of natural length (24 nucleotides), exhibits a nearly complete absence of unintended editing in human cells, even when targeting sites that are prone to off-target activity with wildtype SpyCas9. We also validate at least six variant protospacer adjacent motifs (PAMs), in addition to the preferred consensus PAM (5’-N 4 GATT-3’), for NmeCas9 genome editing in human cells. Conclusions Our results show that NmeCas9 is a naturally high-fidelity genome editing enzyme and suggest that additional Cas9 orthologs may prove to exhibit similarly high accuracy, even without extensive engineering.

Abstract Methods derived from CUT&RUN and CUT&Tag enable genome-wide mapping of the localization of proteins on chromatin from as few as one cell. These and other mapping approaches focus on one protein at a time, preventing direct measurements of colocalization of different chromatin proteins in the same cells and requiring prioritization of targets where samples are limiting. Here we describe multi-CUT&Tag, an adaptation of CUT&Tag that overcomes these hurdles by using antibody-specific barcodes to simultaneously map multiple proteins in the same cells. Highly specific multi-CUT&Tag maps of histone marks and RNA Polymerase II uncovered sites of co-localization in the same cells, active and repressed genes, and candidate cis-regulatory elements. Single-cell multi-CUT&Tag profiling facilitated identification of distinct cell types from a mixed population and characterization of cell type-specific chromatin architecture. In sum, multi-CUT&Tag increases the information content per cell of epigenomic maps, facilitating direct analysis of the interplay of different proteins on chromatin.

ABSTRACT Establishment of a healthy ovarian reserve is contingent upon numerous regulatory pathways during embryogenesis. Previously, mice lacking TBP-associated factor 4b ( Taf4b ) were shown to exhibit a diminished ovarian reserve. However, potential oocyte-intrinsic functions of TAF4b have not been examined. Here we use a combination of gene expression profiling and chromatin mapping to characterize the TAF4b gene regulatory network in mouse oocytes. We find that Taf4b -deficient oocytes display inappropriate expression of meiotic, chromatin, and X-linked genes, and unexpectedly we found a connection with Turner Syndrome pathways. Using Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN), we observed TAF4b enrichment at genes involved in meiosis and DNA repair, some of which are differentially expressed in Taf4b -deficient oocytes. Interestingly, TAF4b target genes were enriched for Sp/KLF family motifs rather than TATA-box, suggesting an alternate mode of promoter interaction. Together, our data connects several gene regulatory nodes that contribute to the ovarian reserve.

MTF1 is a conserved metal-binding transcription factor in eukaryotes that binds to conserved DNA sequence motifs, termed metal response elements (MREs). MTF1 responds to metal excess and deprivation, protects cells from oxidative and hypoxic stresses, and is required for embryonic development in vertebrates. We used multiple strategies to identify an unappreciated role for MTF1 and copper (Cu) in cell differentiation. Upon initiation of myogenesis from primary myoblasts, MTF1 expression increased, as did nuclear localization. Mtf1 knockdown impaired differentiation, while addition of non-toxic concentrations of Cu+ enhanced MTF1 expression and promoted myogenesis. Cu+ bound stoichiometrically to a C-terminus tetra-cysteine of MTF1. MTF1 bound to chromatin at the promoter regions of myogenic genes and binding was stimulated by copper. MTF1 formed a complex with MyoD at myogenic promoters, the master transcriptional regulator of the myogenic lineage. These studies establish novel mechanisms by which copper and MTF1 regulate gene expression in myoblast differentiation.

Major cell fate decisions are governed by sequence-specific transcription factors (TFs) that act in small cell populations within developing embryos. To understand how TFs regulate cell fate it is important to identify their genomic binding sites in these populations. However, current methods cannot profile TFs genome-wide at or near the single cell level. Here we adapt the CUT&RUN method to profile chromatin proteins in low cell numbers, mapping TF-DNA interactions in single cells and individual pre-implantation embryos for the first time. Using this method, we demonstrate that the pluripotency TF NANOG is significantly more dependent on the SWI/SNF family ATPase BRG1 for association with its genomic targets in vivo than in cultured cells, a finding that could not have been made using traditional approaches. Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN) enables interrogation of TF binding from low cell numbers, with broad applicability to rare cell populations of importance in development or disease.

Neuroblastoma remains a formidable challenge in pediatric oncology, representing 15% of cancer-related mortalities in children. Despite advancements in combinatorial and targeted treatments improving survival rates, nearly 50% of patients with high-risk neuroblastoma will ultimately succumb to their disease. Dysregulation of the epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key mechanism of tumor cell dissemination, resulting in metastasis and poor outcomes in many cancers. Our prior work identified PRMT5 as a key regulator of EMT via methylation of AKT at arginine 15, enhancing the expression of EMT-driving transcription factors and facilitating metastasis. Here, we identify that PRMT5 directly regulates the transcription of the epidermal growth factor receptor (EGFR). PRMT5, through independent modulation of the EGFR and AKT pathways, orchestrates the activation of NFκB, resulting in the upregulation of the pro-EMT transcription factors ZEB1, SNAIL, and TWIST1. Notably, EGFR and AKT form a compensatory feedback loop, reinforcing the expression of these EMT transcription factors. Small molecule inhibition of PRMT5 methyltransferase activity disrupts EGFR/AKT signaling, suppresses EMT transcription factor expression and ablates tumor growth in vivo. Our findings underscore the pivotal role of PRMT5 in the control of the EMT program in high-risk neuroblastoma.

Abstract Methylation is a widely occurring modification that requires the methyl donor S-adenosylmethionine (SAM) and acts in regulation of gene expression and other processes. SAM is synthesized from methionine, which is imported or generated through the 1-carbon cycle (1CC). Alterations in 1CC function have clear effects on lifespan and stress responses, but the wide distribution of this modification has made identification of specific mechanistic links difficult. Exploiting a dynamic stress-induced transcription model, we find that two SAM synthases in Caenorhabditis elegans , SAMS-1 and SAMS-4, contribute differently to modification of H3K4me3, gene expression and survival. We find that sams-4 enhances H3K4me3 in heat shocked animals lacking sams-1 , however, sams-1 cannot compensate for sams-4 , which is required to survive heat stress. This suggests that the regulatory functions of SAM depend on its enzymatic source and that provisioning of SAM may be an important regulatory step linking 1CC function to phenotypes in aging and stress.