ABSTRACT A number of in vitro studies have examined the acquisition of drug resistance to the triazole fluconazole, a first-line treatment for many Candida infections. Much less is known about posaconazole, a newer triazole. We conducted the first in vitro experimental evolution of replicates from eight diverse strains of C. albicans in a high level of the fungistatic drug posaconazole. Approximately half of the 132 evolved replicates survived 50 generations of evolution, biased towards some of the strain backgrounds. We found that although increases in drug resistance were rare, increases in drug tolerance (the slow growth of a subpopulation of cells in a level of drug above the resistance level) were common across strains. We also found that adaptation to posaconazole resulted in widespread cross-tolerance to other azole drugs. Widespread aneuploidy variation was also observed in evolved replicates from some strain backgrounds. Trisomy of chromosomes 3, 6, and R was identified in 11 of 12 whole-genome sequenced evolved SC5314 replicates. These findings document rampant evolved cross-tolerance among triazoles and highlight that increases in drug tolerance can evolve independently of drug resistance in a diversity of C. albicans strain backgrounds.

Boric acid is a broad-spectrum antimicrobial used to treat vulvovaginal candidiasis when patients relapse on the primary azole drug fluconazole. Candida albicans is the most common cause of vulvovaginal candidiasis, colloquially referred to as a "vaginal yeast infection". Little is known about the propensity of C. albicans to develop BA resistance or tolerance (the ability of a subpopulation to grow slowly in high levels of drug). We evolved 96 replicates from eight genotypically diverse C. albicans strains to increasing BA concentrations to examine whether they would evolve BA resistance and/or tolerance. We found that many replicates went extinct quickly. Although some replicates were able to grow in much higher levels of BA than the ancestral strains, evolved populations isolated from the highest terminal BA levels surprisingly showed only modest growth improvements and only at low levels of BA. No large increases in resistance or tolerance were observed in the evolved replicates. Overall, our findings illustrate that there may be evolutionary constraints limiting the emergence of BA resistance and tolerance, which could explain why it remains an effective treatment for recurrent yeast infections.

Variation in baseline ploidy is seen throughout the tree of life, yet the factors that determine why one ploidy level is selected over another remain poorly understood. Experimental evolution studies using asexual fungal microbes with manipulated ploidy levels intriguingly reveals a propensity to return to the historical baseline ploidy, a phenomenon that we term "ploidy drive". We evolved haploid, diploid, and polyploid strains of the human fungal pathogen Candida albicans under three different nutrient limitation environments to test whether these conditions, hypothesized to select for low ploidy levels, could counteract ploidy drive. Strains tended to maintain or acquire smaller genome sizes in minimal medium and under phosphorus depletion compared to in a complete medium, yet tended to maintain or acquire increased genome sizes under nitrogen depletion. Surprisingly, improvements in fitness often ran counter to changes in total nuclear genome size; in a number of scenarios lines that maintained their original genome size often increased in fitness more than lines that converged towards diploidy. Combined, this work demonstrates a role for both the environment and genotype in determination of the rate of ploidy drive, and highlights questions that remain about the force(s) that cause genome size variation.

Abstract In vitro studies suggest that stress may generate random standing variation, and that different cellular and ploidy states may evolve more rapidly under stress. Yet this idea has not been tested with pathogenic fungi growing within their host niche in vivo . Here, we analyzed the generation of both genotypic and phenotypic diversity during exposure of Candida albicans to the mouse oral cavity. Ploidy, aneuploidy, loss of heterozygosity (LOH) and recombination were determined using flow cytometry and ddRADseq. Colony phenotypic changes (CPs) in size and filamentous growth were evident without selection, and were enriched among colonies selected for LOH of the GAL1 marker. Aneuploidy and LOH occurred on all chromosomes (Chrs), with aneuploidy more frequent for smaller Chrs and whole Chr LOH more frequent for larger Chrs. Large genome shifts in ploidy to haploidy often maintained one or more heterozygous disomic Chrs, consistent with random Chr missegregation events. Most isolates displayed several different types of genomic changes, suggesting that the oral environment rapidly generates diversity de novo. In sharp contrast, following in vitro propagation isolates were not enriched for multiple LOH events, except in those that underwent haploidization and/or had high levels of Chr loss. The frequency of events was overall 100 times higher for C. albicans populations following in vivo passage compared to in vitro . These hyperdiverse in vivo isolates likely provide C. albicans with the ability to adapt rapidly to the diversity of stress environments it encounters inside the host. Author summary Adaption is a continuous dynamic process that requires genotypic and phenotypic variation. Here we studied the effects of a single passage in a mouse oropharyngeal model of infection on the appearance of diversity in C. albicans, a common commensal of the human oral cavity and GI tract. We found that variation could be rapidly detected following oral colonization, with the frequency of genome change being considerably higher with pre-selection for recombination and colony phenotypic changes. Importantly, one third of all isolates had multiple genome changes, significantly higher than expected by chance alone. We suggest that some cells in the population are naturally hypervariable and that they are a major source of diversity upon which selection can act in stressful conditions in vivo and in vitro .

Variation is the spice of life or, in the case of evolution, variation is the necessary material on which selection can act to enable adaptation. Karyotypic variation in ploidy (the number of homologous chromosome sets) and aneuploidy (imbalance in the number of chromosomes) are fundamentally different than other types of genomic variants. Karyotypic variation emerges through different molecular mechanisms than other mutational events, and unlike mutations that alter the genome at the base pair level, rapid reversion to the wild type chromosome number is often possible. Although karyotypic variation has long been noted and discussed by biologists, interest in the importance of karyotypic variants in evolutionary processes has spiked in recent years, and much remains to be discovered about how karyotypic variants are produced and subsequently selected.

Convergent adaptation can occur at the genome scale when independently evolving lineages use the same genes to respond to similar selection pressures. These patterns provide insights into the factors that facilitate or constrain the diversity of genetic responses that contribute to adaptive evolution. A first step in studying such factors is to quantify the observed amount of repeatability relative to expectations under a null hypothesis. Here, we formulate a novel metric to quantify the constraints driving the observed amount of repeated adaptation in pairwise contrasts based on the hypergeometric distribution, and then generalize this for simultaneous analysis of multiple lineages. This metric is explicitly based on the probability of observing a given amount of repeatability by chance under an arbitrary null hypothesis, and is readily compared among different species and types of trait. We also formulate a metric to quantify the effective proportion of genes in the genome that have the potential to contribute to adaptation. As an example of how these metrics can be used to draw inferences, we assess the amount of repeatability observed in existing datasets on adaptation to antibiotics in yeast and climate in conifers. This approach provides a method to test a wide range of hypotheses about how different kinds of factors can facilitate or constrain the diversity of genetic responses observed during adaptive evolution.

Patient outcomes during infection are due to a complex interplay between the quality of medical care, host immunity factors, and the infecting pathogen’s characteristics. To probe the influence of pathogen genotype on human immune response and disease, we examined Cryptococcus neoformans isolates collected during the Cryptococcal Optimal ART Timing (COAT) trial in Uganda. We measured human participants’ immunologic phenotypes, meningitis disease parameters, and survival. We compared this clinical data to whole genome sequences from 38 C. neoformans isolates of the most frequently observed sequence type (ST) ST93 in our Ugandan participant population, and an additional 18 strains from 9 other sequence types representing the known genetic diversity within the Ugandan Cryptococcus clinical isolates. We focused our analyses on 652 polymorphisms that: were variable among the ST93 genomes, were not in centromeres or extreme telomeres, and were predicted to have a fitness effect. Logistic regression and principal component analyses identified 40 candidate Cryptococcus genes and 3 hypothetical RNAs associated with human immunologic response or clinical parameters. We infected mice with 17 available KN99α gene deletion strains for these candidate genes and found that 35% (6/17) directly influenced murine survival. Four of the six gene deletions that impacted murine survival were novel. Such bedside-to-bench translational research provides important candidate genes for future studies on virulence-associated traits in human Cryptococcus infections.

The importance of within-species diversity in determining the evolutionary potential of a population to evolve drug resistance or tolerance is not well understood, including in eukaryotic pathogens. To examine the influence of genetic background, we evolved replicates of twenty different clinical isolates of Candida albicans, a human fungal pathogen, in fluconazole, the commonly used antifungal drug. The isolates hailed from the major C. albicans clades and had different initial levels of drug resistance and tolerance to the drug. The majority of replicates rapidly increased in fitness in the evolutionary environment, with the degree of improvement inversely correlated with ancestral strain fitness in the drug. Improvement was largely restricted to up to the evolutionary level of drug: only 4% of the evolved replicates increased resistance (MIC) above the evolutionary level of drug. Prevalent changes were altered levels of drug tolerance (slow growth of a subpopulation of cells at drug concentrations above the MIC) and increased diversity of genome size. The prevalence and predominant direction of these changes differed in a strain-specific manner but neither correlated directly with ancestral fitness or improvement in fitness. Rather, low ancestral strain fitness was correlated with high levels of heterogeneity in fitness, tolerance, and genome size among evolved replicates. Thus, ancestral strain background is an important determinant in mean improvement to the evolutionary environment as well as the diversity of evolved phenotypes, and the range of possible responses of a pathogen to an antimicrobial drug cannot be captured by in-depth study of a single strain background.Importance Antimicrobial resistance is an evolutionary phenomenon with clinical implications. We tested how replicates from diverse strains of Candida albicans , a prevalent human fungal pathogen, evolve in the commonly-prescribed antifungal drug fluconazole. Replicates on average increased in fitness in the level of drug they were evolved to, with the least fit ancestral strains improving the most. Very few replicates increased resistance above the drug level they were evolved in. Notably, many replicates increased in genome size and changed in drug tolerance (a drug response where a subpopulation of cells grow slowly in high levels of drug) and variability among replicates in fitness, tolerance and genome size was higher in strains that initially were more sensitive to the drug. Genetic background influenced the average degree of adaptation and the evolved variability of many phenotypes, highlighting that different strains from the same species may respond and adapt very differently during adaptation.

Abstract Candida albicans is the most prevalent cause of vulvovaginal candidiasis (‘yeast infection’) and recurrent vulvovaginal candidiasis, though the incidence of non-albicans yeast species is increasing. The azole fluconazole is the primary antifungal drug used to treat R/VVC yet isolates from some species have intrinsic resistance to fluconazole, and recurrent infection can occur even with fluconazole-susceptible populations. The second-line broad-spectrum antimicrobial drug, boric acid, is an alternative treatment that has been found to successfully treat complicated VVC infections. Far less is known about how boric acid inhibits growth of yeast isolates in different morphologies compared to fluconazole. We found significant differences in drug resistance and drug tolerance (the ability of a subpopulation to grow slowly in high levels of drug) between C. albicans, C. glabrata , and C. parapsilosis isolates, with the specific relationships dependent on both drug and phenotype. Population-level variation for both susceptibility and tolerance was broader for fluconazole than boric acid in all species. Unlike fluconazole, which neither prevented hyphal formation nor disrupted mature biofilms, boric acid inhibited C. albicans hyphal formation and reduced mature biofilm biomass and metabolic activity in all isolates in a dose-dependent manner. Variation in planktonic response did not generally predict biofilm phenotypes. Overall, our findings illustrate that boric acid is broadly effective at inhibiting growth across many isolates and morphologies, which could explain why it is an effective treatment for R/VVC.

ABSTRACT Billions of years of evolution have produced only slight variations in the standard genetic code, and the number and identity of proteinogenic amino acids have remained mostly consistent throughout all three domains of life. These observations suggest a certain rigidity of the genetic code and prompt musings as to the origin and evolution of the code. Here we conducted an adaptive laboratory evolution (ALE) to push the limits of the code restriction, by evolving Escherichia coli to fully replace tryptophan, thought to be the latest addition to the genetic code, with the analog L-β-(thieno[3,2- b ]pyrrolyl)alanine ([3,2]Tpa). We identified an overshooting of the stress response system to be the main inhibiting factor for limiting ancestral growth upon exposure to β-(thieno[3,2- b ]pyrrole ([3,2]Tp), a metabolic precursor of [3,2]Tpa, and Trp limitation. During the ALE, E. coli was able to “calm down” its stress response machinery, thereby restoring growth. In particular, the inactivation of RpoS itself, the master regulon of the general stress response, was a key event during the adaptation. Knocking out the rpoS gene in the ancestral background independent of other changes conferred growth on [3,2]Tp. Our results add additional evidence that frozen regulatory constraints rather than a rigid protein translation apparatus are Life’s gatekeepers of the canonical amino acid repertoire. This information will not only enable us to design enhanced synthetic amino acid incorporation systems but may also shed light on a general biological mechanism trapping organismal configurations in a status quo. SIGNIFICANCE STATEMENT The (apparent) rigidity of the genetic code, as well as its universality, have long since ushered explorations into expanding the code with synthetic, new-to-nature building blocks and testing its boundaries. While nowadays even proteome-wide incorporation of synthetic amino acids has been reported on several occasions 1–3 , little is known about the underlying mechanisms. We here report ALE with auxotrophic E. coli that yielded successful proteome-wide replacement of Trp by its synthetic analog [3,2]Tpa accompanied with the selection for loss of RpoS 4 function. Such laboratory domestication of bacteria by the acquisition of rpoS mitigation mutations is beneficial not only to overcome the stress of nutrient (Trp) starvation but also to evolve the paths to use environmental xenobiotics (e.g. [3,2]Tp) as essential nutrients for growth. We pose that regulatory constraints rather than a rigid and conserved protein translation apparatus are Life’s gatekeepers of the canonical amino acid repertoire (at least where close structural analogs are concerned). Our findings contribute a step towards understanding possible environmental causes of genetic changes and their relationship to evolution. Our evolved strain affords a platform for homogenous protein labeling with [3,2]Tpa as well as for the production of biomolecules 5 , which are challenging to synthesize chemically. Top-down synthetic biology will also benefit greatly from breaking through the boundaries of the frozen bacterial genetic code, as this will enable us to begin creating synthetic cells capable to utilize an expanded range of substrates essential for life.