Abstract The intrinsically disordered protein, α-synuclein, implicated in synaptic vesicle homeostasis and neurotransmitter release, is also associated with several neurodegenerative diseases. The different roles of α-synuclein are characterized by distinct structural states (membrane-bound, dimer, tetramer, oligomer, and fibril), which are originated from its various monomeric conformations. The pathological states, determined by the ensemble of α-synuclein monomer conformations and dynamic pathways of interconversion between dominant states, remain elusive due to their transient nature. Here, we use inter-dye distance distributions from bulk time-resolved Förster resonance energy transfer as restraints in discrete molecular dynamics simulations to map the conformational space of the α-synuclein monomer. We further confirm the generated conformational ensemble in orthogonal experiments utilizing far-UV circular dichroism and cross-linking mass spectrometry. Single-molecule protein-induced fluorescence enhancement measurements show that within this conformational ensemble, some of the conformations of α-synuclein are surprisingly stable, exhibiting conformational transitions slower than milliseconds. Our comprehensive analysis of the conformational ensemble reveals essential structural properties and potential conformations that promote its various functions in membrane interaction or oligomer and fibril formation.

Abstract Mainstream virus detection relies on the specific amplification of nucleic acids via polymerase chain reaction, a process that is slow and requires extensive laboratory expertise and equipment. Other modalities, such as antigen-based tests, allow much faster virus detection but have reduced sensitivity. In this study, we report the development of a flow virometer for the specific and rapid detection of single nanoparticles based on confocal microscopy. The combination of laminar flow and multiple dyes enable the detection of correlated fluorescence signals, providing information on nanoparticle volumes and specific chemical composition properties, such as viral envelope proteins. We evaluated and validated the assay using fluorescent beads and viruses, including SARS-CoV-2. Additionally, we demonstrate how hydrodynamic focusing enhances the assay sensitivity for detecting clinically-relevant virus loads. Based on our results, we envision the use of this technology for clinically relevant bio-nanoparticles, supported by the implementation of the assay in a portable and user-friendly setup.

Abstract Super-resolution light microscopy techniques facilitate the observation of nanometer-size biomolecules, which are 1-2 orders of magnitude smaller than the diffraction limit of light. Using super-resolution microscopy techniques it is possible to observe fluorescence from two biomolecules in close proximity, however not necessarily in direct interaction. Using FRET-sensitized acceptor emission localization (FRETsael), we localize biomolecular interactions exhibiting FRET with nanometer accuracy, from two color fluorescence lifetime imaging data. The concepts of FRETsael were tested first against simulations, in which the recovered localization accuracy is 20-30 nm for true-positive detections of FRET pairs. Further analyses of the simulation results report the conditions in which true-positive rates are maximal. We then show the capabilities of FRETsael on simulated samples of Actin-Vinculin and ER-ribosomes interactions, as well as on experimental samples of Actin-Myosin two-color confocal imaging. Conclusively, the FRETsael approach paves the way towards studying biomolecular interactions with improved spatial resolution from laser scanning confocal two color fluorescence lifetime imaging.

Alpha-Synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein that forms oligomers and fibrils associated with Parkinsons disease. As such, the mechanism of its oligomerization and its possible links to neurotoxicity have been the focus of many studies. Out of the numerous oligomer types, dimers are the smallest oligomers of aSyn that have been reported. As such, aSyn dimers serve as the earliest steps in the nucleation of aSyn oligomers and later fibrils. Therefore, it is important to characterize aSyn dimers. The identification of aSyn dimers in ensemble-averaged measurements without the use of chemical modifications have been difficult, due to their apparent low abundance. Using analytical anion exchange chromatography coupled to multi angle light scattering as well as to dynamic light scattering, we show that recombinant aSyn is in equilibrium between different types of monomers and compact dimers, and that both are abundant. Additionally, bulk Forster resonance energy transfer (FRET), fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) of FRET and pulsed-interleaved excitation single-molecule FRET (PIE smFRET) measurements of mixtures of donor- and acceptor-labeled aSyn. These measurements indicated a dimer dissociation constant of 1.75 micromolar. We concluded that aSyn dimers exist as abundant species in equilibrium with monomers only if produced to reach concentrations of hundreds of nanomolar or above.

Abstract Fluorescent proteins (FP) are frequently used for studying proteins inside cells. In advanced fluorescence microscopy, FPs can report on additional intracellular variables. One variable is the local density near FPs, which can be useful in studying densities within cellular bio-condensates. Here, we show that a reduction in fluorescence lifetimes of common monomeric FPs reports increased levels of local densities. We demonstrate the use of this fluorescence-based variable to report the distribution of local densities within heterochromatin protein 1α (HP1α) in mouse embryonic stem cells (ESCs), before and after early differentiation. We find that local densities within HP1α condensates in pluripotent ESCs are heterogeneous and cannot be explained by a single liquid phase. Early differentiation, however, induces a change towards a more homogeneous distribution of local densities, which can be explained as a liquid-like phase. In conclusion, we provide a fluorescence-based method to report increased local densities and apply it to distinguish between homogeneous and heterogeneous local densities within bio-condensates.