Abstract The ability to alter single bases without DNA double strand breaks provides a potential solution for multiplex editing of livestock genomes for quantitative traits. Here, we report using a single base editing system, Base Editor 3 (BE3), to induce nonsense codons (C-to-T transitions) at four target sites in caprine FGF5. All five progenies produced from microinjected single-cell embryos had alleles with a targeted nonsense mutation and yielded expected phenotypes. The effectiveness of BE3 to make single base changes varied considerably based on sgRNA design. Also, the rate of mosaicism differed between animals, target sites, and tissue type. PCR amplicon and whole genome resequencing analyses for off-target changes caused by BE3 were low at a genome-wide scale. This study provides first evidence of base editing in livestock, thus presenting a potentially better method to introgress complex human disease alleles into large animal models and provide genetic improvement of complex health and production traits in a single generation.

Cyclic GMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS), a major cytosolic DNA sensor, activates innate immune responses by producing cGAMP, which activates stimulator of interferon genes (STING) 1 . Cytosolic DNA induces autophagy in a cGAS-dependent manner to avoid persistent immune stimulation. Although dsDNAs < 20 bp can bind to cGAS, robust cGAS activation requires dsDNAs > 45 bp 2-4 . However, whether cytosolic dsDNAs < 45 bp exist in mammalian cells remains unclear. Here, we identified a class of small cytosolic DNAs (scDNAs) of ∼20–40 bp in human and mouse cell lines. scDNAs competed with herring testis DNA (HT-DNA, ∼200–1500 bp) for binding to cGAS, and repressing HT-DNA-induced cGAS activation and the associated interferon β (IFNβ) production. Moreover, scDNAs promoted cGAS and Beclin-1 interaction, triggering the release of Rubicon, a negative regulator of phosphatidylinositol 3-kinase class III (PI3KC3) 5,6 , from the Beclin-1–PI3KC3 complex, activating PI3KC3 and inducing autophagy. DNA damage decreased and autophagy inducers increased scDNA levels. scDNA transfection or autophagy induction attenuated DNA damage-induced cGAS-STING activation and IFNβ expression. Thus, scDNAs acted as molecular brakes of cGAS activation, preventing excessive inflammatory cytokine production following DNA damage. Our findings lay foundations for understanding the physiological and pathological functions of scDNAs.

ABSTRACT In comparison to mouse, the developmental process of human islets has not been properly elucidated. The advancement of single cell RNA-seq technology enables us to study the properties of alpha and beta cells at single cell resolution. By using mitochondrial genome variants as endogenous lineage-tracing markers, we found that human alpha and beta cells have different lineage features. This finding suggests specific endocrine progenitors for alpha and beta cells, which is different from mouse islet cells. This strategy was also applied to a study of chemically-induced islet cell reprogramming and was used to help identify artemether-induced alpha-to-beta trans-differentiation in human islets. The computational results of this study will inspire future studies to establish, maintain, and expand beta cell-specific progenitors in vitro and in vivo .

Abstract Optogenetics is a valuable tool for studying the mechanisms of neurological diseases and is now being developed for therapeutic applications. In rodents and macaques, improved channelrhodopsins have been applied to achieve transcranial optogenetic stimulation. While transcranial photoexcitation of neurons has been achieved, noninvasive optogenetic inhibition for treating hyperexcitability-induced neurological disorders has remained elusive. There is a critical need for effective inhibitory optogenetic tools that are highly light-sensitive and capable of suppressing neuronal activity in deep brain tissue. In this study, we developed a highly sensitive K + -conductive channelrhodopsin (hsKCR) by molecular engineering of the recently discovered Hyphochytrium catenoides kalium (potassium) channelrhodopsin 1. Transcranial activation of hsKCR significantly prolongs the time to the first seizure, increases survival, and decreases seizure activity in several mouse epileptic models. Our approach for transcranial optogenetic inhibition of neural hyperactivity may be adapted for cell type-specific neuromodulation in both basic and preclinical settings.

Abstract The transcription factor TEAD, together with its coactivator YAP/TAZ, is a key transcriptional modulator of the Hippo pathway. Activation of TEAD transcription by YAP has been implicated in a number of malignancies, and this complex represents a promising target for drug discovery. However, both YAP and its extensive binding interfaces to TEAD have been difficult to address using small molecules, mainly due to a lack of druggable pockets. TEAD is post-translationally modified by palmitoylation that targets a conserved cysteine at a central pocket, which provides an opportunity to develop cysteine-directed covalent small molecules for TEAD inhibition. Here, we employed covalent fragment screening approach followed by structure-based design to develop an irreversible TEAD inhibitor MYF-03-69. Using a range of in vitro and cell-based assays we demonstrated that through a covalent binding with TEAD palmitate pocket, MYF-03-69 disrupts YAP-TEAD association, suppresses TEAD transcriptional activity and inhibits cell growth of Hippo signaling defective malignant pleural mesothelioma (MPM). Further, a cell viability screening with a panel of 903 cancer cell lines indicated a high correlation between TEAD-YAP dependency and the sensitivity to MYF-03-69. Transcription profiling identified the upregulation of proapoptotic BMF gene in cancer cells that are sensitive to TEAD inhibition. Further optimization of MYF-03-69 led to an in vivo compatible compound MYF-03-176, which shows strong antitumor efficacy in MPM mouse xenograft model via oral administration. Taken together, we disclosed a story of the development of covalent TEAD inhibitors and its high therapeutic potential for clinic treatment for the cancers that are driven by TEAD-YAP alteration.

Abstract The bacterial pathogen Legionella pneumophila delivers more than 330 effector proteins into host cells through its Dot/Icm type IV secretion system (T4SS) to facilitate its intracellular replication. A number of these effectors modulate organelle trafficking pathways to create a membrane-bound niche called the Legionella containing vacuole (LCV). In this study, we found that L. pneumophila induces F-actin accumulation in host cell cortex by its Dot/Icm substrate RavJ (Lpg0944). RavJ harbors an C 101 H 138 D 170 motif associated with human tissue transglutaminases (TGs). We showed that RavJ catalyzes a covalent linkage between actin and the Motin family proteins Angiomotin (AMOT) and Angiomotin-like 1 (AMOTL1), proteins known to regulate tube formation and cell migration. Further study revealed that RavJ-induced crosslink between actin and AMOT occurs on its Gln 354 residue. Crosslink between actin and AMOT significantly reduces the binding between actin and its binding partner cofilin, suggesting that RavJ inhibits actin depolymerization. We also demonstrated that the metaeffector LegL1 directly interacts with RavJ to antagonize its transglutaminase activity, leading to reduced crosslink between actin and Motin proteins. Our results reveal a novel mechanism of modulating the host actin cytoskeleton by L. pneumophila .

Background Extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type (ENTKL), is an aggressive hematological malignancy with poor prognosis. Early detection of tumors at initial diagnosis or during routine surveillance is important for improving survival outcomes. Molecular profiling of circulating tumor DNA (ctDNA) is a promising noninvasive tool for monitoring disease status. Here, we investigated the feasible of ctDNA detection in ENTKL.Methods Plasma ctDNA was assessment were based on blood specimens that were collected from 65 patients recently diagnosed with ENKTL at the hematology medical center of Xinqiao Hospital, longitudinal samples collected under chemotherapy also included. Gene mutation spectrum of ENKTL was analyzed via cancer personalized profiling sequencing (CAPP-Seq). This study is registered with ClinicalTrials.gov (ChiCTR1800014813)Results From February 2017 to September 2019, 65 patients were enrolled, we found that the most frequently mutated genes were KMT2D (23.1%), APC (12.3%), ATM (10.8%), ASXL3 (9.2%), JAK3 (9.2%), SETD2 (9.2%), TP53 (9.2%), NOTCH1 (7.7%). The mutation frequencies of KMT2D was significantly higher in stage III-IV, and mutations in KMT2D, ASXL3 and JAK3 were significantly correlated with the metabolic tumor burden of the patients. Compared with tumor tissue DNA, ctDNA profiling showed good concordance. Serial ctDNA analysis showed that treatment with chemotherapy could decrease the number and mutation allele frequency of genes. Compared with PET/CT, ctDNA has more advantages for tracking residual disease in patients. In addition, we also found that mutated KMT2D predicted poor prognosis in patients.Conclusion Collectively, our results provide evidence that ctDNA may serve as a novel precision medicine biomarker in ENKTL.* ENTKL : Extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type CT : Computed tomography Non-NHL : non-Hodgkin lymphoma cfDNA : circulating cell-free DNA ctDNA : circulating tumor DNA DLBCL : diffuse large B-cell lymphoma CAPP-Seq : cancer personalized profiling sequencing MTV : metabolic tumor volume ADAM3A : ADAM Metallopeptidase Domain 3A APC : Adenomatous Polyposis Coli Protein ARID1A : AT-Rich Interaction Domain 1A ARID1B : AT-Rich Interaction Domain 1B ARID2 : AT-Rich Interaction Domain 2 ASXL3 : ASXL Transcriptional Regulator 3 ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated BCOR : BCL6 Corepressor BCORL1 : BCL6 Corepressor Like 1 CHD8 : Chromodomain Helicase DNA Binding Protein 8 CREBBP : CREB Binding Protein DDX3X : DEAD-Box Helicase 3 X-Linked DNMT3A : DNA Methyltransferase 3 Alpha EP300 : E1A Binding Protein P300 EZH2 : Enhancer Of Zeste 2 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit FYN : Src Family Tyrosine Kinase IDH2 : Isocitrate Dehydrogenase (NADP(+)) 2, Mitochondrial IL2RG : Interleukin 2 Receptor Subunit Gamma JAK1 : Janus Kinase 1 JAK3 : Janus Kinase3 KDM6A : Lysine Demethylase 6A KMT2A : Lysine Methyltransferase 2A KMT2D : Lysine Methyltransferase 2D MGA : MAX Dimerization Protein NF1 : Neurofibromin 1 NOTCH1 : Notch Receptor 1 PRDM1 : Positive Regulatory Domain I-Binding Factor 1 PTPN1 : Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 1 RHOA : Ras Homolog Family Member A SETD2 : SET Domain Containing 2 SOCS1 : Suppressor of Cytokine Signaling 1 STAT3 : Signal Transducer and Activator of Transcription 3 STAT5B : Signal Transducer and Activator of Transcription 5B STAT6 : Signal Transducer and Activator of Transcription 6 TET1 : Tet Methylcytosine Dioxygenase 1 TNFRSF14 : TNF Receptor Superfamily Member 14 TP53 : Tumor Protein P53 TRAF3 : TNF Receptor Associated Factor 3 ZAP608 : Zeta Chain Of T Cell Receptor Associated Protein Kinase 608 MAF : mutated allele frequency SNV : single nucleotide variant