The dental follicle is an ectomesenchymal tissue surrounding the developing tooth germ. It is believed that this tissue contains stem cells and lineage committed progenitor cells or precursor cells (PCs) for cementoblasts, periodontal ligament cells, and osteoblasts. In this study, we report the isolation of PCs derived from dental follicle of human third molar teeth. These fibroblast-like, colony forming and plastic adherent cells expressed putative stem cell markers Notch-1 and Nestin. We compared gene expressions of PCs, human mesenchymal stem cells (hMSCs), periodontal ligament cells (PDL-cells) and osteoblasts (MG63) for delimitation of PCs. Interestingly, PCs expressed higher amounts of insulin-like growth factor-2 (IGF-2) transcripts than hMSCs. Differentiation capacity was demonstrated under in vitro conditions for PCs. Long-term cultures with dexamethasone produced compact calcified nodules or appeared as plain membrane structures of different dimensions consisting of a connective tissue like matrix encapsulated by a mesothelium-like cellular structure. PCs differentially express osteocalcin (OCN) and bone sialoprotein (BS) after transplantation in immunocompromised mice but without any sign of cementum or bone formation. Therefore, our results demonstrate that cultured PCs are unique undifferentiated lineage committed cells residing in the periodontium prior or during tooth eruption.

Plants are sessile organisms that gauge stressful conditions to ensure survival and reproductive success. While plants in nature often encounter chronic or recurring stressful conditions, the strategies to cope with those are poorly understood. Here, we demonstrate the involvement of ARGONAUTE1 and the microRNA pathway in the adaptation to recurring heat stress (HS memory) at the physiological and molecular level. We show that miR156 isoforms are highly induced after HS and are functionally important for HS memory. miR156 promotes sustained expression of HS-responsive genes and is critical only after HS, demonstrating that the effects of modulating miR156 on HS memory do not reflect preexisting developmental alterations. miR156 targets SPL transcription factor genes that are master regulators of developmental transitions. SPL genes are posttranscriptionally downregulated by miR156 after HS, and this is critical for HS memory. Altogether, the miR156-SPL module mediates the response to recurring HS in Arabidopsis thaliana and thus may serve to integrate stress responses with development.

Abstract The epithelial lining of the fallopian tube is of critical importance for human reproduction and has been implicated as a site of origin of high-grade serous ovarian cancer. Here we report on the establishment of long-term, stable 3D organoid cultures from human fallopian tubes, indicative of the presence of adult stem cells. We show that single epithelial stem cells in vitro can give rise to differentiated organoids containing ciliated and secretory cells. Continuous growth and differentiation of organoids depend on both Wnt and Notch paracrine signalling. Microarray analysis reveals that inhibition of Notch signalling causes downregulation of stem cell-associated genes in parallel with decreased proliferation and increased numbers of ciliated cells and that organoids also respond to oestradiol and progesterone treatment in a physiological manner. Thus, our organoid model provides a much-needed basis for future investigations of signalling routes involved in health and disease of the fallopian tube.

Detailed knowledge of the molecular biology of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection is crucial for understanding of viral replication, host responses, and disease progression. Here, we report gene expression profiles of three SARS-CoV- and SARS-CoV-2-infected human cell lines. SARS-CoV-2 elicited an approximately two-fold higher stimulation of the innate immune response compared to SARS-CoV in the human epithelial cell line Calu-3, including induction of miRNA-155. Single-cell RNA sequencing of infected cells showed that genes induced by virus infections were broadly upregulated, whereas interferon beta/lambda genes, a pro-inflammatory cytokines such as IL-6, were expressed only in small subsets of infected cells. Temporal analysis suggested that transcriptional activities of interferon regulatory factors precede those of nuclear factor κB. Lastly, we identified heat shock protein 90 (HSP90) as a protein relevant for the infection. Inhibition of the HSP90 activity resulted in a reduction of viral replication and pro-inflammatory cytokine expression in primary human airway epithelial cells.

Resource3 February 2020Open Access Source DataTransparent process Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment Karen Hoffmann Karen Hoffmann Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Hilmar Berger Hilmar Berger Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Hagen Kulbe Hagen Kulbe Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Sukanija Thillainadarasan Sukanija Thillainadarasan Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Hans-Joachim Mollenkopf Hans-Joachim Mollenkopf Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Tomasz Zemojtel Tomasz Zemojtel BIH Genomics Core Unit, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Eliane Taube Eliane Taube Department of Pathology, Charité University Medicine, Campus Charité, Berlin, Germany Search for more papers by this author Silvia Darb-Esfahani Silvia Darb-Esfahani Department of Pathology, Charité University Medicine, Campus Charité, Berlin, Germany Search for more papers by this author Mandy Mangler Mandy Mangler Department of Gynecology, Vivantes Auguste-Viktoria-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Jalid Sehouli Jalid Sehouli Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Radoslav Chekerov Radoslav Chekerov Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Elena I Braicu Elena I Braicu Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Thomas F Meyer Corresponding Author Thomas F Meyer [email protected] orcid.org/0000-0002-6120-8679 Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Mirjana Kessler Corresponding Author Mirjana Kessler [email protected] orcid.org/0000-0002-9879-1052 Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Karen Hoffmann Karen Hoffmann Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Hilmar Berger Hilmar Berger Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Hagen Kulbe Hagen Kulbe Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Sukanija Thillainadarasan Sukanija Thillainadarasan Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Hans-Joachim Mollenkopf Hans-Joachim Mollenkopf Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Tomasz Zemojtel Tomasz Zemojtel BIH Genomics Core Unit, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Eliane Taube Eliane Taube Department of Pathology, Charité University Medicine, Campus Charité, Berlin, Germany Search for more papers by this author Silvia Darb-Esfahani Silvia Darb-Esfahani Department of Pathology, Charité University Medicine, Campus Charité, Berlin, Germany Search for more papers by this author Mandy Mangler Mandy Mangler Department of Gynecology, Vivantes Auguste-Viktoria-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Jalid Sehouli Jalid Sehouli Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Radoslav Chekerov Radoslav Chekerov Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Elena I Braicu Elena I Braicu Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany Search for more papers by this author Thomas F Meyer Corresponding Author Thomas F Meyer [email protected] orcid.org/0000-0002-6120-8679 Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Mirjana Kessler Corresponding Author Mirjana Kessler [email protected] orcid.org/0000-0002-9879-1052 Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany Search for more papers by this author Author Information Karen Hoffmann1,6, Hilmar Berger1, Hagen Kulbe2, Sukanija Thillainadarasan1, Hans-Joachim Mollenkopf1, Tomasz Zemojtel3, Eliane Taube4, Silvia Darb-Esfahani4, Mandy Mangler5, Jalid Sehouli2, Radoslav Chekerov2, Elena I Braicu2, Thomas F Meyer *,1 and Mirjana Kessler *,1,6 1Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany 2Department of Gynecology, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany 3BIH Genomics Core Unit, Charité University Medicine, Campus Virchow-Klinikum, Berlin, Germany 4Department of Pathology, Charité University Medicine, Campus Charité, Berlin, Germany 5Department of Gynecology, Vivantes Auguste-Viktoria-Klinikum, Berlin, Germany 6Present address: Department of Internal Medicine/Infectious Diseases and Pulmonary Medicine, Charité University Medicine, Berlin, Germany *Corresponding author. Tel: +49 3028 460400; E-mail: [email protected] *Corresponding author. Tel: +49 3045 0653504; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2020)39:e104013https://doi.org/10.15252/embj.2019104013 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract High-grade serous ovarian cancer (HGSOC) likely originates from the fallopian tube (FT) epithelium. Here, we established 15 organoid lines from HGSOC primary tumor deposits that closely match the mutational profile and phenotype of the parental tumor. We found that Wnt pathway activation leads to growth arrest of these cancer organoids. Moreover, active BMP signaling is almost always required for the generation of HGSOC organoids, while healthy fallopian tube organoids depend on BMP suppression by Noggin. Fallopian tube organoids modified by stable shRNA knockdown of p53, PTEN, and retinoblastoma protein (RB) also require a low-Wnt environment for long-term growth, while fallopian tube organoid medium triggers growth arrest. Thus, early changes in the stem cell niche environment are needed to support outgrowth of these genetically altered cells. Indeed, comparative analysis of gene expression pattern and phenotypes of normal vs. loss-of-function organoids confirmed that depletion of tumor suppressors triggers changes in the regulation of stemness and differentiation. Synopsis The molecular events driving high-grade serous ovarian cancer (HGSOC) from the fallopian tube (FT) epithelium remain unclear. This resource article establishes optimal conditions for stable cultivation of primary HGSOC tissue, and finds that tumor growth requires major signaling changes in the native niche. Decreased Wnt and increased BMP signaling promote long-term expansion of patient-derived HGSOC organoids. HGSOC organoids match parental mutational profile and biomarker expression. Triple knockdown of p53, PTEN and RB in healthy FT organoids predisposes to transformation, but is insufficient for continuous cancer growth. Wnt inhibitor expression is elevated in malignant organoids and Wnt-depletion increases stemness signatures. Introduction High-grade serous ovarian cancer (HGSOC), an occult malignancy which represents 70% of all ovarian cancer cases and has the highest mortality rates (5-year survival rate 30–40%) (Reid et al, 2017), represents a major clinical challenge. Aside from the difficulties in developing new lines of targeted treatments, late detection and lack of understanding of the molecular mechanisms that drive development of the disease remain major hurdles. Studies in BRCA1/2 germline mutation carriers undergoing prophylactic cancer risk-reducing surgery (Leeper et al, 2002; Callahan et al, 2007) identified distinct early malignant changes in the distal part of the FT, leading to widespread acceptance of the theory that the FT is the primary tissue of origin of HGSOC (Vaughan et al, 2011; Bowtell et al, 2015). These lesions, termed small tubal intraepithelial carcinoma (STIC), are also routinely detected in the FT epithelium of ~ 50% of patients at an advanced stage of the disease and were shown to have the same genomic profile as the mature cancer—indicative of a clonal relationship (Kuhn et al, 2012). Nevertheless, all tumor samples genomically and transcriptionally cluster together and closely resemble tubal epithelium, irrespective of whether STICs were detected in the FT (Ducie et al, 2017). Therefore, it remains unclear how cellular transformation occurs, and most importantly, which factors are essential for the development of invasive and metastatic properties, which are necessary for the spread of malignant cells from the FT to the ovary and beyond. Of particular interest in this context is the role of mutant p53, which is almost universally detected in metastatic HGSOC cancers (Cancer Genome Atlas Research Network, 2011), but can occasionally be found in the form of p53 signatures in healthy patients with unclear clinical significance (Lee et al, 2007). Thus, it cannot be excluded that the occurrence of mutated p53 is coupled to additional, independent transformation stimuli that provide a selective advantage during the process of transformation. Several studies have investigated drug responses of different patient-derived 3D models of HGSOC in short-term culture, but conditions suitable for stable long-term cultivation and creation of biobanks have remained elusive (Hill et al, 2018; Maru et al, 2019; Phan et al, 2019). The recently reported generation of organoid cultures from ovarian cancer (Kopper et al, 2019) demonstrated that it is possible, in principle, to maintain the major properties of ovarian cancer tissue in vitro. Notably, while providing a comprehensive overview of the different histological subtypes and stages of the disease, only two cases (five lines in total) from the reported cohort involved samples from primary surgery, while the remainder were pre-exposed to neoadjuvant chemotherapy. Interestingly, four out of five primary HGSOC organoid lines exhibited slow growth, suggesting suboptimal culture conditions. To date, it remains unclear how the stem cell niche is altered in the native HGSOC tumor tissue compared to healthy epithelium. Here, we define growth conditions needed to achieve stable, long-term expansion of HGSOC organoids from primary tumor deposits. We show that the niche composition for stemness maintenance of cancer organoids requires low-Wnt signaling and benefits from active BMP signaling, which is in contrast to the paracrine environment that regulates epithelial homeostasis in healthy FT organoids (Kessler et al, 2015). In total, we have created 15 stable organoid lines from 13 primary deposits of advanced HGSOC patients, which match the mutational and phenotypic profile of the parental tumor. In parallel, we have generated FT organoid cultures from seven different patients with simultaneous depletion of p53, PTEN, and RB (triple shRNA knockdowns), leading to the disruption of major signaling pathways that have been implicated in HGSOC development. Importantly, long-term growth of triple KD organoids could only be sustained in medium adapted for HGSOC organoids. Comparative gene expression analysis of cancer organoids and p53/PTEN/RB triple KDs under different growth conditions revealed common key regulatory changes in markers of stemness and differentiation. This implies that signaling cues from the stem cell environment need to change early during tumorigenesis to facilitate the growth of mutated cells and are preserved in the advanced disease setting. Thus, this study discovers important core principles in the development of HGSOC, which have important implications for understanding early carcinogenesis and disease progression. Results Establishment of HGSOC organoid culture In order to define conditions for long-term in vitro propagation of primary cancer organoids from solid HGSOC deposits, we utilized a combinatorial screening approach, using samples obtained during primary debulking surgery. To avoid potential contribution from healthy fallopian tube or ovarian surface epithelium, only tumor samples from peritoneum and omentum deposits were used. The tissue was not pre-exposed to pharmacological agents, as all but one HGSOC patient underwent radical surgery prior to chemotherapy, in line with local clinical guidelines. Small pieces (1–3 cm) of suspected tumor mass identified by the surgeon were transported to the lab and subjected to cell isolation on the same day. 3D culture was initiated by seeding the cell suspension in Matrigel and supplementation with growth factors (for details see Methods and Protocols). Overall, 15 organoid lines were successfully established from 13 out of 45 patients (~ 30% efficiency), which were classified based on TNM and FIGO staging (Table EV1). The majority had cancer deposits of > 2 cm that had invaded organs outside the pelvis (T3c) and spread to retroperitoneal lymph nodes (N1), but had not metastasized to more distant sites such as the liver or spleen (M0) (Fig 1A). In order to generate a reference data set for each organoid line, the parental tumor sample was divided into three parts for (i) confirmation of the diagnosis by an experienced pathologists using histological analysis of standard HGSOC biomarkers (Fig EV1A), (ii) isolation of DNA and RNA, and (iii) isolation of cells for organoid culture (Fig 1B). Figure 1. Establishment of patient-derived organoids from solid HGSOC deposits Summary of cancer patient data with TNM and FIGO classifications showing advanced stage of disease at the time of surgery. Graphic representation of the standard experimental procedure for tumor patient material. Samples were obtained at the time of primary debulking surgery from the high purity tumor deposits in peritoneum/omentum. In vitro niche dependency of HGSOC tumor cells. Phase-contrast pictures illustrate that isolated ovarian cancer cells rely on EGF supplementation for growth, while they do not grow at all in Wnt3a-supplemented medium. Also, inhibition of BMP signaling through Noggin has strong negative effect on the initial growth. Scale bar: 500 μm. E—EGF, F—FGF10, N—Noggin, R—R-spondin1, B—Basic medium, P—Passage. Cancer organoids express HGSOC markers Pax8 and EpCAM and have lost the cystic phenotype suggesting complete breakdown of epithelial polarity as seen on confocal images from two representative organoid lines. Scale bar: 20 μm. HE staining of organoids and respective tissue confirms high similarity in cellular structure and tissue organization. Scale bar: 100 μm. HGSOC organoids show differential response to carboplatin treatment, confirming patient-specific sensitivity of the cultures. Cell viability assay was performed after 5 days of treatment with different concentrations of carboplatin on mature organoids from three different donors. Data represent mean ± SD of technical triplicates. Download figure Download PowerPoint Click here to expand this figure. Figure EV1. Pathology of HGSOC tumor samples and drug response of HGSOC organoids Diagnosis of ovarian cancer in tissue fragments used for organoid generation was confirmed by experienced pathologists to be of HGSOC phenotype, being marked by strong EpCAM, Pax8, and p16 expression. Depicted are four examples of the pathology stainings. Scale bar: 100 μm. Phase-contrast images of the establishment of HGSOC organoid culture (OC1) showing strong negative effect of low-BMP (presence of Noggin) and high-Wnt signaling, achieved here by the addition of GSK3-β inhibitor CHIR (3 μM) (lower panel). While isolates seeded in EFR medium gave rise to expanding organoids (upper panel), only small aggregates formed in the presence of CHIR (lower left) and entered growth arrest with prominent cell debris indicative of cell death (lower right). This culture could not be further maintained. Scale bar: 500 μm. Three HGSOC organoid lines were tested for their response to the drug carboplatin showing slightly different responses as determined by cell viability assay. Data represent mean ± SD of technical triplicates. Download figure Download PowerPoint By testing media containing different combinations of growth factors (Fig 1C), we identified conditions that support outgrowth and long-term expansion (> 1 year) of cancer-derived organoids. Normal FT organoid medium (FTM) (Table EV2) is supplemented with ROCK and TGF-β receptor inhibitors, as well as Noggin, EGF, FGF, RSPO1, and Wnt3a (Kessler et al, 2015; Kopper et al, 2019). By contrast, HGSOC organoids did not grow in this medium but required several alterations. The only paracrine growth factor that proved indispensable was EGF (E). Most notably, unlike healthy organoids from several different organs (intestinal, FT, gastric, liver, etc.), which require exogenous Wnt activation, not a single organoid line could be maintained in medium containing the Wnt signaling agonist Wnt3a (W) (Fig 1C and Table EV3). Two lines did, however, expand in the presence of the Wnt agonist R-spondin 1 (RSPO1, short R), suggesting that some cultures benefit from the addition of RSPO1 (Fig 1C). In addition, sustained inhibition of BMP signaling by Noggin (N) seems to be detrimental, as removal of Noggin was a prerequisite for successful cultivation in 13/15 HGSOC samples, indicating fundamentally different roles of BMP and Wnt signaling in the regulation of stemness in HGSOC compared to normal tissue. Indeed, activation of Wnt pathway by GSK3-β inhibitor CHIR99201 (CHIR), instead of addition of Wnt3a agonist, also showed clear negative effect on organoid formation and growth supporting conclusion that regulation of stemness potential in HGSOC tissue has altered requirement for Wnt signal (Fig EV1B). In summary, 11/15 cultures could be initiated and expanded in medium containing only EGF, ROCK, and TGF-β inhibitors, but without Noggin—thus allowing endogenous BMP signaling (Table EV3). Five of these 11 samples benefited from the addition of BMP2 for organoid formation, further amplifying BMP signaling (B). As this patient-dependent effect of BMP2 addition was always neutral or positive, BMP2 was subsequently included in the standard medium composition. Therefore, the combination of EGF and BMP2, together with other standard components of organoid medium, i.e., ROCK inhibitor, TGF-β inhibitor, B27, N2, and nicotinamide (consistent with Kopper et al, 2019), was termed ovarian cancer minimal medium (OCM) (Table EV3). Successfully established long-term HGSOC organoid cultures were passaged at a ratio of 1:2 to 1:3 every 10–20 days for at least 5 months prior to cryopreservation. Six lines were kept in culture for > 1 year (Table EV3). Thawed cancer organoids could routinely be expanded to a multi-well screening format and are thus suited for generating live biobanks of HGSOC organoids to explore individual therapeutic options in vitro. Multiple cycles of thawing and freezing were tested on seven different lines without noticeable changes in morphology or expansion potential. Immunofluorescence labeling confirmed that the organoids exhibit all hallmarks of an HGSOC phenotype, including disorganized tissue architecture and loss of polarity (as marked by the absence of a central cavity), an epithelial secretory identity of all cells (strong EpCAM and PAX8 expression), and pleomorphic nuclei (Fig 1D). HE staining further confirmed their morphological similarity to the matching tissue samples (Fig 1E). Next, we tested the in vitro drug response to carboplatin, the major first-line chemotherapeutic agent for HGSOC. As expected, organoids underwent cell death in a concentration-dependent manner, with prominent differences between organoids from different donors suggesting individual variation in drug response among patients (Figs 1F and EV1C). HGSOC organoids match tumor tissue in mutational profile and expression of biomarkers To test whether patient-derived organoid cultures correspond to the individual mutational profile of the parental tumor, we performed targeted sequencing for 121 candidate genes that were selected on the basis of previously published studies of ovarian cancer genomic profiles (Appendix Table S1; Cancer Genome Atlas Research Network, 2011, Norquist et al, 2018). Mutational analysis of 10 paired tumor fragments and organoids from nine different patients revealed that despite the long-term expansion in vitro (DNA samples were collected after 4–10 months in culture, see Table EV3), they retained a high level of similarity, even including allelic frequency, when compared to the tissue that was immediately frozen on the day of surgery (Fig 2A and Table EV4). TP53 mutations were detected in the vast majority of samples (9/10), in agreement with the almost universal occurrence of mutated p53 in HGSOC patients (Cancer Genome Atlas Research Network, 2011). All of the TP53 mutations in the organoid cultures were homozygous (> 0.9 allele frequency), yet diverse with respect to mutation type (missense, nonsense, frame-shift, or splice variant mutations). In addition to somatic mutations with proven tumorigenic potential, a number of known variant alleles were identified, including ROCK2 (c.1292C>A), KIT (c.1621A>C), MLH1 (c.655A>G), and MSH6 (c.472C>T) which could potentially influence the malignant phenotype (Kalender et al, 2010; Nakamura et al, 2014; Brahmi et al, 2015). Apart from TP53, MLH1, and MSH6, we also found point mutations in other genes with functions in DNA repair and chromosome stability, including ATM (c.4534G>A), ATR (c.1517A>G), BRIP1 (c.254T>A), and FANCA (c.1238G>T). Interestingly, while no classic germline or somatic BRCA1/2 mutations were detected apart from three polymorphisms that are weakly associated with ovarian cancer (c.4900A>G, c.3113A>G, c.2612C>T), analysis of protein lysates revealed a significant reduction compared to healthy FT organoids in three of eight cases (OC4, OC2, and OC3; Appendix Fig S1A and Table S2). This strongly suggests the existence of epigenetic or post-transcriptional mechanisms of BRCA1 inactivation in these cases. Altogether, 7/9 patients had mutations in one or more DNA repair gene, in congruence with the fact that HGSOC is a cancer characterized by a particularly high incidence of genomic instability. Given our finding that HGSOC organoids could not be maintained in the presence of Wnt, we noted with interest that three missense mutations in Wnt pathway genes (Fzd9, LRP5, and TCF7L2) were identified in three different patients (Fig 2A), which could impair signal transduction and thus provide further evidence that changes in this pathway play an important role in ovarian carcinogenesis. Complementary to the sequencing data, WB and IF staining were performed to examine the mutational status and subcellular localization of p53 in the organoids (Appendix Table S2). While the nonsense mutation in OC11 as well as the splice variant and frame-shift mutations in OC4 and OC7, respectively, result in loss of p53 (Fig 2B and Appendix Table S2), the missense mutations in OC9 (p.R273H), OC10 (p.R175H), OC1 (p.V25F), and OC6 (p.V173M) result in a gain-of-function and nuclear accumulation phenotype with R273H and R175H being two of the most common mutations in ovarian cancer (Zhang et al, 2016; Fig 2C and Appendix Fig S1B). Figure 2. HGSOC organoids match tumor tissue in mutational profile and gene expression biomarkers Overview of mutations found in organoid cultures and matching tumor tissue obtained by targeted sequencing of 121 HGSOC-related genes confirms almost identical profile between parental tissue and in vitro long-term organoid culture. Color code indicates type of mutations which were detected. Representative Western blot showing loss or overexpression of p53 in individual organoid lines. Strong nuclear p53 signal in immunostainings of HGSOC organoids is indicative of a gain-of-function TP53 mutation. Scale bars: 100 μm (tissue) and 50 μm (organoid). Multi-dimensional scaling (MDS) plot based on the gene expression profiles (microarrays) of three healthy FT and eight tumor tissue samples and their respective organoid cultures shows four clusters: normal FT tissue, normal FT organoids, cancer organoids, and cancer tissue. Box plots depicting overall constant level in normalized expression of major HGSOC marker genes between organoids and parental tissue. Data represent the median, quartiles, maximum, and minimum of the normalized expression from eight different donors. Heat map of differentially expressed genes between cancer and healthy tissue/organoids reveals up-regulation of several HGSOC biomarkers and reduction in FT differentiation markers in the cancer samples. Differential expression determined by single-color microarray for eight different patient samples was significant for all genes with P < 0.05 except for OVGP1 and TOP2A in organoids. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 2 [embj2019104013-sup-0007-SDataFig2.pdf] Download figure Download PowerPoint To more thoroughly evaluate parallels between tissue and organoid cultures, a global gene expression analysis was performed from eight different tumor/organoid pairs as well as three healthy FT tissue/organoid pairs and two FT organoids derived from cancer patients (also classified as normal healthy tissue). The generation of a multi-dimensional-scaling plot (MDS) revealed that the distance between OC and FT organoids is smaller than between corresponding tissues, likely due to the greater complexity of tissue samples, which contain mesenchymal and endothelial components (Fig 2D). Still, despite the tissue heterogeneity, the respective OC organoids express very similar levels of the main cancer markers, like CDKN2A (p16), Muc16, and EpCAM, when compared to the parental sample (Fig 2E). Moreover, correlation analysis of FT and OC organoids (Appendix Fig S1C) shows that FT samples form a homogenous cluster and show less variability in gene expression between each other than OC organoids, which instead reflect the phenotypic diversity of ovarian tumors. A thorough analysis of gene expression revealed that numerous hallmark genes known to be de-regulated in HGSOC are differentially expressed between OC and normal FT samples, not only in the tissue but also in the organoids (Fig 2F). This includes significant up-regulation of the cell cycle regulators CDKN2A and Cyclin E1 (CCNE1) and the transcription factor FOXM1, as well as downregulation of differentiation markers like PGR and OVGP1. The strong up-regulation of Cyclin E1 was validated by Western blot analysis in five out of eight samples tested (Appendix Fig S1D and Table S2), while the level of RB protein itself, which is phosphorylated by Cyclin E1 to promote G1/S progression, was not changed (Appendix Table S2). This indicates potential RB pathway disruption by increased Cyclin E1 levels. Amplification of CCNE1 gene is common in HGSOC (~ 20–30% of cases), but increased levels could also be a result of alternative signaling perturbations. Together, these results demonstrate that the patient-derived OC organoid lines are valid in vitro models of the parental HGSOC tumors, resembling not only the tissue architecture but also the mutational profile and overall gene expression. Stable triple knockdown of p53, PTEN, and RB in FT organoids In the next step, we wanted to analyze at which stage of disease development the observed changes in niche factor requirements occur. This is a question of particular importance in HGSOC, where transformation appears to occur in the FT but cancers are very rarely detected at this site. To mimic the cellular events, like mutation of p53 and loss of PTEN, which characterize the early stages of malignant transformation, we used organoids from healthy FT donor epithelium. In contrast to previous in vitro tumorigenesis models, which were based on the transformation of immortalized primary FT monolayers (Jazaeri et al, 2011; Nakamura et al, 2018), organoids are genomically unaltered and have preserved epithelial polarity and integrity, thus ensuring mucosal homeostasis. In order to model HGSOC development, shRNAs against p53, PTEN, and RB—major known tumor drivers of the disease—were introduced into healthy human FT epithelial cells from donor tissues obtained during surgeries for benign gynecological conditions. The shRNAs were delivered sequentially by retro- and lentiviral vectors into epithelial cells grown in 2D culture, selected by FACS (shPTEN-mCherry, shRB–GFP), and subsequently transferred to Matrigel to initiate organoid formation (Figs

Viruses manipulate cellular metabolism and macromolecule recycling processes like autophagy. Dysregulated metabolism might lead to excessive inflammatory and autoimmune responses as observed in severe and long COVID-19 patients. Here we show that SARS-CoV-2 modulates cellular metabolism and reduces autophagy. Accordingly, compound-driven induction of autophagy limits SARS-CoV-2 propagation. In detail, SARS-CoV-2-infected cells show accumulation of key metabolites, activation of autophagy inhibitors (AKT1, SKP2) and reduction of proteins responsible for autophagy initiation (AMPK, TSC2, ULK1), membrane nucleation, and phagophore formation (BECN1, VPS34, ATG14), as well as autophagosome-lysosome fusion (BECN1, ATG14 oligomers). Consequently, phagophore-incorporated autophagy markers LC3B-II and P62 accumulate, which we confirm in a hamster model and lung samples of COVID-19 patients. Single-nucleus and single-cell sequencing of patient-derived lung and mucosal samples show differential transcriptional regulation of autophagy and immune genes depending on cell type, disease duration, and SARS-CoV-2 replication levels. Targeting of autophagic pathways by exogenous administration of the polyamines spermidine and spermine, the selective AKT1 inhibitor MK-2206, and the BECN1-stabilizing anthelmintic drug niclosamide inhibit SARS-CoV-2 propagation in vitro with IC

ABSTRACT Epidemiological data demonstrate that SARS-CoV-2 variants of concern (VOC) B.1.1.7 and B.1.617.2 are more transmissible and infections are associated with a higher mortality than non-VOC virus infections. Phenotypic properties underlying their enhanced spread in the human population remain unknown. B.1.1.7 virus isolates displayed inferior or equivalent spread in most cell lines and primary cells compared to an ancestral B.1 SARS-CoV-2, and were outcompeted by the latter. Lower infectivity and delayed entry kinetics of B.1.1.7 viruses were accompanied by inefficient proteolytic processing of spike. B.1.1.7 viruses failed to escape from neutralizing antibodies, but slightly dampened induction of innate immunity. The bronchial cell line NCI-H1299 supported 24- and 595-fold increased growth of B.1.1.7 and B.1.617.2 viruses, respectively, in the absence of detectable ACE2 expression and in a spike-determined fashion. Superior spread in NCI-H1299 cells suggests that VOCs employ a distinct set of cellular cofactors that may be unavailable in standard cell lines.

High-grade serous ovarian cancer (HGSOC) likely originates from the fallopian tube (FT) epithelium. Here, we established 15 organoid lines from HGSOC primary tumor deposits that closely match the parental tumor mutational profile and phenotype. We found that Wnt pathway activation leads to growth arrest of these cancer organoids. Moreover, active BMP signaling is almost always required for generation of HGSOC organoids, while healthy FT organoids depend on BMP suppression by Noggin. Interestingly, FT organoids modified by stable shRNA knockdown (KD) of p53, PTEN, and Retinoblastoma (RB), also require a low Wnt environment for long-term growth, while FT organoid medium triggers growth arrest. Thus, early changes in the stem cell niche environment are needed to support outgrowth of these genetically altered cells. Indeed, comparative analysis of gene expression pattern and phenotype of normal and KD organoids confirmed that depletion of tumor suppressors triggers changes in the regulation of stemness and differentiation.