ABSTRACT Iron (Fe) is an essential micronutrient for both plants and animals. Fe limitation significantly reduces crop yield and therefore has adverse impacts on human nutrition. Owing to limited bioavailability of Fe, plants have adapted different strategies that regulate Fe uptake and homeostasis. Particularly, modifications of root growth traits are a key for the survival of plants on Fe-deficient soils. Understanding the molecular basis for these root growth responses will have critical implications for plant breeding. Fe uptake is regulated by a cascade of basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors. In our study, we show that HY5 (Elongated Hypocotyl 5), a member of the basic leucine zipper (bZIP) family of transcription factors plays an important role in the Fe deficiency signalling pathway in Arabidopsis thaliana . The hy5 mutant plants failed to mount an optimum Fe deficiency response and showed severe root growth defects under Fe limitation that could be partially reverted by complementation of hy5 mutant. qRT-PCR analysis revealed that the induction of the genes involved in Fe uptake pathway [FER-like iron deficiency-induced transcription factor ( FIT ), Ferric Reduction Oxidase 2 ( FRO2 ) and Iron-Regulated Transporter1 ( IRT1 )] is significantly reduced in the hy5 mutants as compared to the wild-type plants under Fe deficiency. Moreover, we also found that HY5 function is critical for activating the expression of coumarin biosynthesis genes ( F6’H1, S8H, PDR9 and BGLU42) under Fe deficiency. Interestingly, our results showed that HY5 acts as a negative regulator of BRUTUS ( BTS) which is known to negatively regulate Fe deficiency response. Chromatin Immunoprecipitation followed by qPCR revealed direct binding of HY5 to the promoter of BTS . Altogether, our results showed that HY5 plays an important role in regulation of Fe deficiency responses in Arabidopsis.

Abstract Grass pea ( Lathyrus sativus ) is an ideal legume crop for resource-poor farmers, having resistance to various biotic and abiotic stresses. The seeds of this plant are rich in protein and are the only known dietary source of L-homoarginine. Moreover, it thrives with minimal inputs making it a promising crop in grain legume breeding programs with immense potential for food security. Despite these advantages, the global area under its cultivation has decreased because of the presence of an antinutrient compound, β-N-oxalyl-L-α,β-diamino propionic acid (β-ODAP), which results in neurolathyrism both in humans and animals. Multiple efforts in the past have resulted in the development of improved varieties with low ODAP. Still, due to variations in response to the environment, stable low-ODAP lines have not been developed for large-scale cultivation. In this paper, we report in planta characterization of Oxalyl-CoA Synthetase (OCS) involved in the oxalylating step leading to β-ODAP production. We established a hairy root transformation system for Lathyrus and demonstrated the genome editing of LsOCS . Further, we show that oxalate accumulates in these hairy roots due to loss-of-function of the OCS gene. This is the first report of functional analysis of a Lathyrus gene in Lathyrus . The hairy root genome editing system we developed can be used as a quick system for functional studies of Lathyrus genes.

Abstract Background Iron (Fe) is an essential mineral element, and its deficiency in soil largely affects crop productivity. In plants, the molecular mechanisms underlying the genetic regulation of Fe deficiency responses have yet to be well understood. Specifically, microRNA (miRNA) mediated regulation of Fe deficiency response and its regulatory network is largely elusive. In the current work, we utilized a whole genome transcriptomic approach to identify the Fe deficiency-responsive miRNAs to understand the molecular mechanisms of Fe deficiency response in wheat seedlings. The study also identifies nine novel miRNAs putatively involved in Fe deficiency response. Further, the identified miRNAs showed tissue preferences relating them to differential mechanisms against Fe deficiency. Results In the present study, we performed small RNA-targeted whole genome transcriptome analysis to identify the involvement of sRNAs in Fe deficiency response. The analysis identified 105 differentially expressed miRNAs corresponding to Fe deficiency response, among them, 9 miRNAs were found to be novel in this study. Interestingly, tissue-specific regulation of Fe deficiency response also participates through miRNA-mediated regulation. We identified 17 shoot specific miRNAs and 18 root-specific miRNAs with altered expression. We validated the tissue specificity of these miRNAs by stem-loop quantitative RT-PCR. Further, an attempt was made to predict their targets to speculate their participation in Fe deficiency response. This miRNA target prediction analysis suggested a few major targets of the identified miRNAs, such as multicopper oxidases, E3 ubiquitin ligases, GRAS family, and WRKY transcription factors previously known to play key roles in Fe homeostasis. Our analysis of selected miRNAs also confirmed a temporal regulation of the response. Conclusion The first information generated here will classify the repository of wheat miRNAs (with few novel miRNAs) for their role in Fe deficiency response. Our work provides insights into miRNA-mediated regulatory pathways during Fe deficiency.

Abstract Rhizospheric pH severely impacts plant growth and fitness through a numerous process and has emerged as a major determinant of crop productivity. Despite numerous attempts, the key questions related to plants response against rhizospheric pH remains largely elusive. The present study provides a mechanistic framework for rhizospheric pH-mediated root growth inhibition (RGI). Utilizing various genetic resources combined with pharmacological agents and high-resolution confocal microscopy, the study provides direct evidences for the involvement of jasmonates and auxin in rhizospheric pH-mediated RGI. We show that auxin maxima at root tip is tightly regulated by the rhizospheric pH. In contrast, jasmonates (JAs) abundance inversely correlates with rhizospheric pH. Further, JA mediated regulation of auxin maxima by GRETCHEN HAGEN 3 ( GH3 ) family genes explains the pattern of RGI observed over the entire range of rhizospheric pH. Our findings revealed auxin as the key regulator of RGI during severe pH conditions, while JAs antagonistically regulate auxin response against rhizospheric pH. Highlight The current study identifies the mechanistic framework of rhizospheric pH mediated root growth inhibition in model plant Arabidopsis through a prominent crosstalk between two phytohormones i.e. auxin and jasmonates.

Iron is an essential micronutrient for all organisms. In crop plants, iron deficiency can decrease crop yield significantly, however our current understanding of how major crops respond to iron deficiency remains limited. Herein, the effect of Fe deprivation at both the transcriptomic and metabolic levels in hexaploid wheat was investigated. Genome-wide gene expression reprogramming was observed in wheat roots subjected to Fe starvation, with a total of 5854 genes differential expressed. Homoeolog and subgenome specific analysis unveiled induction bias contribution from the A and B genomes. In general, the predominance of genes encoding for nicotianamine synthase, yellow stripe like transporters, metal transporters, ABC transporters and zinc-induced facilitator-like protein was noticed. Expression of genes related to the strategy-II mode of Fe uptake was predominant as well. Our transcriptomic data were in agreement with the GC-MS analysis that showed the enhanced accumulation of various metabolites such as fumarate, malonate, succinate and xylofuranose, which could be contributing to Fe-mobilization. Interestingly, Fe starvation leads to significant temporal increase of glutathione-S-transferase both at transcriptional and in enzymatic activity levels, which indicates the involvement of glutathione in response to Fe stress in wheat roots. Taken together, our result provides new insight into the wheat response to Fe starvation at molecular level and lays foundation to design new strategies for the improvement of Fe nutrition in crops.

Background: Hexaploid wheat is an important cereal crop that has been targeted to enhance grain micronutrient content including zinc and iron. In this direction, modulating the expression of plant transporters involved in Fe and Zn homeostasis could be one of the promising approaches. Therefore, the present work was undertaken to identify bread wheat Zinc Induced Facilitator-Like (ZIFL) family of transporters and study their transcriptional expression response during micronutrient fluctuations and exposure to multiple heavy metals. Results: The genomewide analyses resulted in identification of thirty-five putative TaZIFL genes, which were distributed only on Chromosome 3, 4 and 5. Wheat ZIFL proteins subjected to the phylogenetic analysis showed the uniform distribution along with rice, Arabidopsis and maize. In-silico analysis of the promoters of the wheat ZIFL genes suggested the presence of multiple metal binding sites including those which are involved in Fe homeostasis. QRT-PCR analysis of wheat ZIFL genes suggested the differential regulation of the transcripts in roots and shoots under surplus Zn and also during Fe starvation. Specifically, in roots, TaZIFL2.3, TaZIFL4.1, TaZIFL4.2, TaZIFL5, TaZIFL6.1 and TaZIFL6.2 were significantly up-regulated by both Zn and Fe. This suggested that ZIFL could possibly be regulated by both the nutrient stress in a tissue specific manner. Interestingly, upon exposure to heavy metals, TaZIFL4.2 and TaZIFL7.1 showed significant up-regulation, whereas TaZIFL5 and TaZIFL6.2 remained almost unaffected. Conclusion: This is the first report with detailed analysis of wheat ZIFL genes. Our study also identifies closest ortholog for transporter of mugineic acid, a chelator required for Fe uptake. Comprehensive transcript expression pattern during development of wheat seedlings and against various abiotic/biotic stresses resulted in tissue specific responses. Overall, this work addresses the role of wheat ZIFL during the interplay between micronutrient and heavy metal stress in a tissue specific manner.

ABSTRACT Iron (Fe) and phosphorus (P) are the essential mineral nutrient for plant growth and development. However, the molecular interaction of the Fe and P pathways in crops remained largely obscure. In this study, we provide a comprehensive physiological and molecular analysis of hexaploid wheat response to single (Fe, P) and its combinatorial deficiencies. Our data showed that inhibition of the primary root growth occurs in response to Fe deficiency; however, growth was rescued when combinatorial deficiencies occurred. Analysis of RNAseq revealed that distinct molecular rearrangements during combined deficiencies with predominance for genes related to metabolic pathways and secondary metabolite biosynthesis primarily include genes for UDP-glycosyltransferase, cytochrome-P450s, and glutathione metabolism. Interestingly, the Fe-responsive cis-regulatory elements in the roots in Fe stress conditions were enriched compared to the combined stress. Our metabolome data also revealed the accumulation of distinct metabolites such as amino-isobutyric acid, arabinonic acid, and aconitic acid in the combined stress environment. Overall, these results are essential in developing new strategies to improve the resilience of crops in limited nutrients. HIGHLIGHTS This study was performed to understand the molecular changes occurring during the interaction of Phosphorus (P) and Iron (Fe) in hexaploid wheat roots. P and Fe show cross-talk as Fe deficiency-induced phenotype that was restored by the withdrawal of P. A total of 2780 differentially expressed genes were identified in the roots with the combined –Fe–P deficiencies with predominance for UDP-glycosyltransferases, cytochrome-450 and glutathione-S-transferases transcripts. The metabolomic changes identified the importance of amino-isobutyric acid, arabinonic acid and aconitic acid during dual deficiency This work provides a comprehensive insight to understand the molecular rearrangements occurring in wheat roots during Fe and P interaction.

Abstract Iron (Fe) is an essential nutrient for plants that is indispensable for many physiological activities. Although few genotypes were identified with contrasting tolerance to Fe deficiency, the molecular insight into the distinct biochemical and transcriptional responses determining the trait is poorly known. This study aimed to identify the molecular and biochemical basis for the contrasting Fe deficiency tolerance in wheat genotype showing tolerance to Fe deficiency (cv. Kanchan-KAN) compared to susceptible (cv. PBW343-PBW) cultivar. Under Fe deficiency, the KAN show delayed chlorosis, high SPAD values and low malondialdehyde activity compared to PBW. The shoot transcriptomics studies show that a large set of genes for photosynthetic pathways were highly induced in PBW, suggesting its sensitivity to Fe deficiency. Although, under Fe deficiency, both the cultivars show distinct molecular re-arrangements, including high expression of genes involved in Fe uptake (including membrane transporters) and mobilization, the gene expression level was higher in KAN. Furthermore, the KAN cultivar also shows high ubiquitination activity in the shoot tissue suggesting a high turnover of proteins in the tolerant cultivar. These observations were also co-related with the high root phytosiderophores biosynthesis and its release that contributes to the enhanced Fe translocation index in KAN. Overall, our work provides the key link to understanding the mechanistic insight for the Fe deficiency tolerance in hexaploid wheat. This will enable wheat breeders to select genotypes for better Fe use efficiency for agriculture.

Abstract Asymmetric expression in the bread wheat ( Triticum aestivum ) genome refers to the differential expression of genes from A, B, and D parental genomes. Bread wheat is a hexaploid crop with six copies of each chromosome. This complexity can result in unequal expression of genes from each parental genome, leading to asymmetry in gene expression. In other polyploid crops like cotton, transcription factors (TF) exhibit genome-biased expression; however, there are no comparable studies for bread wheat. One of the most prominent TFs families in plants is the basic Leucine Zippers (bZIP) which are eukaryote-specific proteins and regulate various biological processes, including stress-related responses. bZIP proteins are dimeric and several heptads long. They exhibit typical coiled-coil structures with strategically placed amino acids in each heptad, responsible for their stability and specificity. Here, we aim to decipher the structural basis of the asymmetric expression of the bZIP TFs in wheat under low and high-temperature conditions. Furthermore, 19 highly expressed stress-related TabZIP TFs were analysed for their asymmetric expression profiles as plants were exposed to temperature-stress conditions. Two benchmarks were used to analyse the asymmetric gene expression of bZIPs, i.e., a) the promoter’s occupancy by the epigenetic marker histones, namely, H3K4me3, H3k9ac (active) and H3K27me3 (repressive), b) density and diversity of cis-regulatory elements in the promoters. Notably, the genetic basis of the differences in protein sequences of bZIP triads was explored, which may impart structural stability to a specific homeolog enabling the plant to endure the stress conditions better.

Iron is one of the important micronutrients that is not just essential for the human body, but also required for crop productivity and yield-related traits. To address the Fe homeostasis in crop plants, multiple transporters belonging to the category of Major facilitator superfamily are being explored. In this direction, Vacuolar iron transporters (VIT) are being reported and have been characterized functionally as an important candidate to address biofortification in cereal crops. In the present study, the identification and characterization of new members of Vacuolar iron transporters-like proteins (VTL) was performed. Phylogenetic analyses demonstrated distinct clustering of all the VTL genes from the previously known VIT genes. Our analysis identifies multiple VTL genes from hexaploid wheat with the highest number of this gene family localized on chromosome 2. Quantitative expression analysis suggests that most of the VTL genes are induced only during the Fe surplus condition, thereby reinforcing their role metal homeostasis. Interestingly, most of the wheat VTL genes were significantly up-regulated in a tissue-specific manner under Zn, Mn and Cu deficiency conditions. Although, no significant changes in expression of wheat VTL genes were observed in roots under heavy metals, but TaVTL2, TaVTL3 and TaVTL5 were upregulated in the presence of cobalt stress. Overall, this work deals with the characterization of wheat VTL genes that could provide an important genetic resource for addressing metal homeostasis in bread wheat.