Rhodococcus sp. strain BCP1 was initially isolated for its ability to grow on gaseous n-alkanes, which act as inducers for the co-metabolic degradation of low-chlorinated compounds. Here, both molecular and metabolic features of BCP1 cells grown on gaseous and short-chain n-alkanes (up to n-heptane) were examined in detail. We show that propane metabolism generated terminal and sub-terminal oxidation products such as 1- and 2-propanol, whereas 1-butanol was the only terminal oxidation product detected from butane metabolism. Two gene clusters, prmABCD and smoABCD – coding for soluble di-iron monooxgenases (SDIMOs) involved in gaseous n-alkanes oxidation – were detected in the BCP1 genome. By means of reverse transcriptase-quantitative PCR (RT-qPCR) analysis, a set of substrates inducing the expression of the sdimo genes in BCP1 were assessed as well as their transcriptional repression in the presence of sugars, organic acids or during the cell growth on rich medium (Luria Bertani broth). The transcriptional start sites of both the sdimo gene clusters were identified by means of primer extension experiments. Finally, proteomic studies revealed changes in the protein pattern induced by growth on gaseous- (n-butane) and/or liquid (n-hexane) short-chain n-alkanes as compared to growth on succinate. Among the differently expressed protein spots, two chaperonins and an isocytrate lyase were identified along with oxidoreductases involved in oxidation reactions downstream of the initial monooxygenase reaction step.

Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 and Ochrobactrum sp. MPV1 were isolated from the rhizosphere soil of the selenium-hyperaccumulator legume Astragalus bisulcatus and waste material from a dumping site for roasted pyrites, respectively. Here, these bacterial strains were studied as cell factories to generate selenium-nanostructures (SeNS) under metabolically controlled growth conditions. Thus, a defined medium (DM) containing either glucose or pyruvate as carbon and energy source along with selenite (SeO32-) was tested to evaluate bacterial growth, oxyanion bioconversion and changes occurring in SeNS features with respect to those generated by these strains grown on rich media. Transmission Electron Microscopy (TEM) images show extra- or intra-cellular emergence of SeNS in SeITE02 or MPV1 respectively, revealing the presence of two distinct biological routes of SeNS biogenesis. Indeed, the stress exerted by SeO32- upon SeITE02 cells triggered the production of membrane vesicles (MVs), which surrounded Se-nanoparticles (SeNPs), as highlighted by TEM and Scanning Electron Microscopy (SEM), strongly suggesting that MVs might play a crucial role in the excreting mechanism of the SeNPs in the extracellular environment. On the other hand, MPV1 strain biosynthesized intracellular inclusions likely containing hydrophobic storage compounds and SeNPs under pyruvate conditioning, while the growth on glucose as the only source of carbon and energy led to the production of a mixed population of intracellular SeNPs and nanorods (SeNRs). SEM, fluorescence spectroscopy, and Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) revealed that the biogenic SeNS were enclosed in an organic material containing proteins and amphiphilic molecules, possibly responsible for the high thermodynamic stability of these nanomaterials. Finally, the biogenic SeNS extracts were photoluminescent, whose degree of fluorescence emission was comparable to that from chemically synthesized SeNPs with L-cysteine (L-cys SeNPs). This study offers novel insights into the formation, localization, and release of biogenic SeNS generated by two different Gram-negative bacterial strains under aerobic and metabolically controlled growth conditions. The work strengthens the possibility of using these bacterial isolates as eco-friendly biocatalysts to produce high quality SeNS targeted to possible biomedical applications and other biotechnological purposes.

Abstract

 We report the identification of the proteins encoded by the mttABC operon (formerly yigTUW), which mediate a novel Sec-independent membrane targeting and translocation system in Escherichia coli that interacts with cofactor-containing redox proteins having a S/TRRXFLK "twin arginine" leader motif. A pleiotropic-negative mutant in mttA prevents the periplasmic localization of twin arginine redox enzymes, including nitrate reductase (NapA) and trimethylamine N-oxide reductase (TorA). The mutation also prevents the correct localization of the integral membrane molybdoenzyme dimethylsulfoxide reductase (DmsABC). The DmsA subunit has a twin arginine leader. Proteins with a Sec-dependent leader or which assemble spontaneously in the membrane are not affected by this mutation. MttA, B, and C are members of a large family of related sequences extending from archaebacteria to higher eukaryotes.

Arsenic (As) ranks among the priority metal(loid)s that are of public health concern. In the environment, arsenic is present in different forms, organic or inorganic, featured by various toxicity levels. Bacteria have developed different strategies to deal with this toxicity involving different resistance genetic determinants. Bacterial strains of Rhodococcus genus, and more in general Actinobacteria phylum, have the ability to cope with high concentrations of toxic metalloids, although little is known on the molecular and genetic bases of these metabolic features. Here we show that Rhodococcus aetherivorans BCP1, an extremophilic actinobacterial strain able to tolerate high concentrations of organic solvents and toxic metalloids, can grow in the presence of high concentrations of As(V) (up to 240 mM) under aerobic growth conditions using glucose as sole carbon and energy source. Notably, BCP1 cells improved their growth performance as well as their capacity of reducing As(V) into As(III) when the concentration of As(V) is within 30-100 mM As(V). Genomic analysis of BCP1 compared to other actinobacterial strains revealed the presence of three gene clusters responsible for organic and inorganic arsenic resistance. In particular, two adjacent and divergently oriented ars gene clusters include three arsenate reductase genes (arsC1/2/3) involved in resistance mechanisms against As(V). A sequence similarity network (SSN) and phylogenetic analysis of these arsenate reductase genes indicated that two of them (ArsC2/3) are functionally related to thioredoxin (Trx)/thioredoxin reductase (TrxR)-dependent class and one of them (ArsC1) to the mycothiol (MSH)/mycoredoxin (Mrx)-dependent class. A targeted transcriptomic analysis performed by RT-qPCR indicated that the arsenate reductase genes as well as other genes included in the ars gene cluster (possible regulator gene, arsR, and arsenite extrusion genes, arsA, acr3, and arsD) are transcriptionally induced when BCP1 cells were exposed to As(V) supplied at two different sub-lethal concentrations. This work provides for the first time insights into the arsenic resistance mechanisms of a Rhodococcus strain, revealing some of the unique metabolic requirements for the environmental persistence of this bacterial genus and its possible use in bioremediation procedures of toxic metal contaminated sites.

The present study deals with Se(0)- and Te(0)-based nanoparticles bio-synthesized by two selenite- and tellurite-reducing bacterial strains, namely Stenotrophomonas maltophilia SeITE02 and Ochrobactrum sp. MPV1, isolated from polluted sites. We evidenced that, by regulating culture conditions and exposure time to the selenite and tellurite oxyanions, differently sized zero-valent Se and Te nanoparticles were produced. The results revealed that these Se(0) and Te(0) nanoparticles possess antimicrobial and biofilm eradication activity against Escherichia coli JM109, Pseudomonas aeruginosa PAO1, and Staphylococcus aureus ATCC 25923. In particular, Se(0) nanoparticles exhibited antimicrobial activity at quite low concentrations, below that of selenite. Toxic effects of both Se(0) and Te(0) nanoparticles can be related to the production of reactive oxygen species upon exposure of the bacterial cultures. Evidence so far achieved suggests that the antimicrobial activity seems to be strictly linked to the dimensions of the nanoparticles: indeed, the highest activity was shown by nanoparticles of smaller sizes. In particular, it is worth noting how the bacteria tested in biofilm mode responded to the treatment by Se(0) and Te(0) nanoparticles with a susceptibility similar to that observed in planktonic cultures. This suggests a possible exploitation of both Se(0) and Te(0) nanoparticles as efficacious antimicrobial agents with a remarkable biofilm eradication capacity.

Tellurite (TeO32-) is recognized as a toxic oxyanion to living organisms. However, mainly anaerobic or facultative-anaerobic microorganisms are able to tolerate and convert TeO32- into the less toxic and available form of elemental Tellurium (Te0), producing Te-deposits or Te-nanostructures. The use of TeO32--reducing bacteria can lead to the decontamination of polluted environments and the development of "green-synthesis" methods for the production of nanomaterials. In this study, the tolerance and the consumption of TeO32- have been investigated, along with the production and characterization of Te-nanorods by Rhodococcus aetherivorans BCP1 grown under aerobic conditions.Aerobically grown BCP1 cells showed high tolerance towards TeO32- with a minimal inhibitory concentration (MIC) of 2800 μg/mL (11.2 mM). TeO32- consumption has been evaluated exposing the BCP1 strain to either 100 or 500 μg/mL of K2TeO3 (unconditioned growth) or after re-inoculation in fresh medium with new addition of K2TeO3 (conditioned growth). A complete consumption of TeO32- at 100 μg/mL was observed under both growth conditions, although conditioned cells showed higher consumption rate. Unconditioned and conditioned BCP1 cells partially consumed TeO32- at 500 μg/mL. However, a greater TeO32- consumption was observed with conditioned cells. The production of intracellular, not aggregated and rod-shaped Te-nanostructures (TeNRs) was observed as a consequence of TeO32- reduction. Extracted TeNRs appear to be embedded in an organic surrounding material, as suggested by the chemical-physical characterization. Moreover, we observed longer TeNRs depending on either the concentration of precursor (100 or 500 μg/mL of K2TeO3) or the growth conditions (unconditioned or conditioned grown cells).Rhodococcus aetherivorans BCP1 is able to tolerate high concentrations of TeO32- during its growth under aerobic conditions. Moreover, compared to unconditioned BCP1 cells, TeO32- conditioned cells showed a higher oxyanion consumption rate (for 100 μg/mL of K2TeO3) or to consume greater amount of TeO32- (for 500 μg/mL of K2TeO3). TeO32- consumption by BCP1 cells led to the production of intracellular and not aggregated TeNRs embedded in an organic surrounding material. The high resistance of BCP1 to TeO32- along with its ability to produce Te-nanostructures supports the application of this microorganism as a possible eco-friendly nanofactory.

Abstract This is a paper focusing on the comparison of growth curves using field relevant testing methods and moving away from colony counts. Challenges exist to explore antimicrobial growth of fastidious strains, poorly culturable bacterial and bacterial communities of environmental interest. Thus, various approaches have been explored to follow bacteria growth that can be an efficient surrogate for classical optical density or colony forming unit measurements. Here we tested optical density, ATP assays, DNA concentrations and 16S rRNA qPCR as means to monitor pure culture growth of six different species including Acetobacterium woodii, Bacillus subtilis, Desulfovibrio vulgaris, Geoalkalibacter subterraneus, Pseudomonas putida and Thauera aromatica . Optical density is and excellent, rapid monitoring method of pure culture planktonic cells but cannot be applied to environmental or complex samples. ATP assays provide rapid results but conversions to cell counts may be misleading for different species. DNA concentration is a very reliable technique which can be used for any sample type and provides genetic materials for downstream applications. qPCR of the 16S rRNA gene is a widely applicable technique for monitoring microbial cell concentrations but is susceptible to variation between replicates. DNA concentrations were found to correlate the best with the other three assays and provides the advantages of rapid extraction, consistency between replicates and potential for downstream analysis, DNA concentrations is determined to be the best universal monitoring method for complex environmental samples.

Abstract Effective and accurate primer design is an increasingly important skill as the use of PCR-based diagnostics in clinical and environmental settings is on the rise. While universal primer sets have been successfully designed for highly conserved core genes such as 16S rRNA and characteristic genes such as dsrAB and dnaJ , primer sets for mobile, accessory genes such as multidrug resistance efflux pumps (MDREP) have not been explored. Here, we describe an approach to create universal primer sets for select MDREP genes chosen from five superfamilies (SMR, MFS, MATE, ABC and RND) identified in a model community of six members (Acetobacterium woodii, Bacillus subtilis, Desulfovibrio vulgaris, Geoalkalibacter subterraneus, Pseudomonas putida and Thauera aromatica). Using sequence alignments and in silico PCR analyses, a new approach for creating universal primers sets targeting mobile, non-conserved genes has been developed and compared to more traditional approaches used for highly conserved genes. A discussion of the potential shortfalls of the primer sets designed this way are described. The approach described here can be adapted to any unique gene set and aid in creating a wider, more robust library of primer sets to detect less conserved genes and improve the field of PCR-based screening research. Importance Increasing use of molecular detection methods, specifically PCR and qPCR, requires utmost confidence in the results while minimizing false positives and negatives due to poor primer designs. Frequently, these detection methods are focused on conserved, core genes which limits their applications. These screening methods are being used in various industries for specific genetic targets or key organisms such as viral or infectious strains, or characteristic genes indicating the presence of key metabolic processes. The significance of this work is to improve primer design approaches to broaden the scope of detectable genes. The use of the techniques explored here will improve detection of non-conserved genes through unique primer design approaches. Additionally, the approaches here highlight additional, important information which can be gleaned during the in silico phase of primer design which will improve our gene annotations based on sequence homologies.

Abstract The antibacterial and antibiofilm efficacy of our novel pentafluorosulfanyl-containing triclocarban analogs was explored against seven different Gram-positive and Gram-negative indicator strains. After initial screening, they had bactericidal and bacteriostatic activity against Gram-positive bacteria, especially Staphylococcus aureus and MRSA (methicillin–resistant staphylococcus aureus) in a very low concentration. Our results were compared with the most common antibiotic being used (Ciprofloxacin and Gentamycin); the novel components had significantly better antibacterial and antibiofilm activity in lower concentrations in comparison to the antibiotics. For instance, EBP- 59 minimum inhibitory concentration was < 0.0003 mM, while ciprofloxacin 0.08 mM. Further antibacterial activity of novel components was surveyed against 10 clinical antibiotic resistance MRSA isolates. Again, novel components had significantly better antibacterial and antibiofilm activity in comparison with antibiotics. Mechanistic studies have revealed that none of these novel compounds exhibit any effect on the reduced thiol, disrupting iron sulfur clusters, or hydrogen peroxide pathways. Instead, their impact is attributed to the disruption of the Gram-positive bacterial cell membrane. Toxicity and safety testing on tissue cell culture showed promising results for the safety of components to the host.