Summary Epstein-Barr virus (EBV) subverts host epigenetic pathways to switch between viral latency programs, colonize the B-cell compartment and reactivate. Within memory B-cells, the reservoir for lifelong infection, EBV genomic DNA and histone methylation marks restrict gene expression. But, this epigenetic strategy also enables EBV-infected tumors, including Burkitt lymphomas to evade immune detection. Little is known about host cell metabolic pathways that support EBV epigenome landscapes. We therefore used amino acid restriction, metabolomic and CRISPR approaches to identify that an abundant methionine supply, and interconnecting methionine and folate cycles, maintain Burkitt EBV gene silencing. Methionine restriction, or methionine cycle perturbation, hypomethylated EBV genomes, de-repressed latent membrane protein and lytic gene expression. Methionine metabolism also shaped EBV latency gene regulation required for B-cell immortalization. Dietary methionine restriction altered murine Burkitt xenograft metabolomes and de-repressed EBV immunogens in vivo . These results highlight epigenetic/immunometabolism crosstalk supporting the EBV B-cell lifecycle and suggest therapeutic approaches. Highlights Methionine metabolism is critical for Epstein-Barr virus B-cell latency Extensive cross-talk enables methionine metabolism to control the EBV epigenome Methionine restriction also impairs EBV-driven human B-cell immortalization Dietary methionine restriction unmasks EBV antigens in Burkitt xenografts in vivo

Abstract Epstein-Barr virus (EBV) is associated with 200,000 cancers annually, including B-cell lymphomas in immunosuppressed hosts. Hypomorphic mutations of the de novo pyrimidine synthesis pathway enzyme cytidine 5’ triphosphate synthase 1 (CTPS1) suppress cell mediated immunity, resulting in fulminant EBV infection and EBV+ central nervous system (CNS) lymphomas. Since CTP is a critical precursor for DNA, RNA and phospholipid synthesis, this observation raises the question of whether the isozyme CTPS2 or cytidine salvage pathways help meet CTP demand in EBV-infected B-cells. Here, we found that EBV upregulated CTPS1 and CTPS2 with distinct kinetics in newly infected B-cells. While CRISPR CTPS1 knockout caused DNA damage and proliferation defects in lymphoblastoid cell lines (LCL), which express the EBV latency III program observed in CNS lymphomas, double CTPS1/2 knockout caused stronger phenotypes. EBNA2, MYC and non-canonical NF-□B positively regulated CTPS1 expression. CTPS1 depletion impaired EBV lytic DNA synthesis, suggesting that latent EBV may drive pathogenesis with CTPS1 deficiency. Cytidine rescued CTPS1/2 deficiency phenotypes in EBV-transformed LCL and Burkitt B-cells, highlighting CTPS1/2 as a potential therapeutic target for EBV-driven lymphoproliferative disorders. Collectively, our results suggest that CTPS1 and CTPS2 have partially redundant roles in EBV-transformed B-cells and provide insights into EBV pathogenesis with CTPS1 deficiency.

The Epstein-Barr virus (EBV) oncogene latent membrane protein 1 (LMP1) mimics CD40 signaling and is expressed by multiple malignancies. Two LMP1 C-terminal cytoplasmic tail regions, termed transformation essential sites (TES) 1 and 2, are critical for EBV transformation of B lymphocytes into immortalized lymphoblastoid cell lines (LCL). However, TES1 versus TES2 B-cell target genes have remained incompletely characterized, and whether both are required for LCL survival has remained unknown. To define LCL LMP1 target genes, we profiled transcriptome-wide effects of acute LMP1 CRISPR knockout (KO) prior to cell death. To then characterize specific LCL TES1 and TES2 roles, we conditionally expressed wildtype, TES1 null, TES2 null or double TES1/TES2 null LMP1 alleles upon endogenous LMP1 KO. Unexpectedly, TES1 but not TES2 signaling was critical for LCL survival. The LCL dependency factor cFLIP, which plays obligatory roles in blockade of LCL apoptosis, was highly downmodulated by loss of TES1 signaling. To further characterize TES1 vs TES2 roles, we conditionally expressed wildtype, TES1 and/or TES2 null LMP1 alleles in two Burkitt models. Systematic RNAseq analyses revealed gene clusters that responded more strongly to TES1 versus TES2, that respond strongly to both or that are oppositely regulated. Robust TES1 effects on cFLIP induction were again noted. TES1 and 2 effects on expression of additional LCL dependency factors, including BATF and IRF4, and on EBV super-enhancers were identified. Collectively, these studies suggest a model by which LMP1 TES1 and TES2 jointly remodel the B-cell transcriptome and highlight TES1 as a key therapeutic target.

Human cytomegalovirus (HCMV) infects up to 80% of the world's population. Here, we show that HCMV infection leads to widespread changes in human chromatin accessibility and chromatin looping, with hundreds of thousands of genomic regions affected 48 hours after infection. Integrative analyses reveal HCMV-induced perturbation of Hippo signaling through drastic reduction of TEAD1 transcription factor activity. We confirm extensive concordant loss of TEAD1 binding, active H3K27ac histone marks, and chromatin looping interactions upon infection. Our data position TEAD1 at the top of a hierarchy involving multiple altered important developmental pathways. HCMV infection reduces TEAD1 activity through four distinct mechanisms: closing of TEAD1-bound chromatin, reduction of YAP1 and phosphorylated YAP1 levels, reduction of TEAD1 transcript and protein levels, and alteration of

Epstein-Barr virus (EBV) uses latency programs to colonize the memory B-cell reservoir, and each program is associated with human malignancies. However, knowledge remains incomplete of epigenetic mechanisms that maintain the highly restricted latency I program, present in memory and Burkitt lymphoma cells, in which EBNA1 is the only EBV-encoded protein expressed. Given increasing appreciation that higher order chromatin architecture is an important determinant of viral and host gene expression, we investigated roles of Wings Apart-Like Protein Homolog (WAPL), a host factor that unloads cohesins to control DNA loop size and that was discovered as an EBNA2-associated protein. WAPL knockout (KO) in Burkitt cells de-repressed LMP1 and LMP2A expression but not other EBV oncogenes to yield a viral program reminiscent of EBV latency II, which is rarely observed in B-cells. WAPL KO also increased LMP1/2A levels in latency III lymphoblastoid cells. WAPL KO altered EBV genome architecture, triggering formation of DNA loops between the LMP promoter region and the EBV origins of lytic replication (oriLyt). Hi-C analysis further demonstrated that WAPL KO reprograms EBV genomic DNA looping. LMP1 and LMP2A de-repression correlated with decreased histone repressive marks at their promoters. We propose that EBV coopts WAPL to negatively regulate latent membrane protein expression to maintain Burkitt latency I.

Abstract Epstein-Barr virus (EBV) causes 200,000 cancers annually. Upon B-cell infection, EBV induces lipid metabolism to support B-cell proliferation. Yet, little is known about how latent EBV infection, or human B-cell stimulation more generally, alter sensitivity to ferroptosis, a non-apoptotic form of programmed cell death driven by iron-dependent lipid peroxidation and membrane damage. To gain insights, we analyzed lipid reactive oxygen species (ROS) levels and ferroptosis vulnerability in primary human CD19+ B-cells infected by EBV or stimulated by key B-cell receptors. Prior to the first mitosis, EBV-infected cells were exquisitely sensitive to blockade of glutathione biosynthesis, a phenomenon not observed with B-cell receptor stimulation. Subsequently, EBV-mediated Burkitt-like hyper-proliferation generated elevated levels of lipid ROS, which necessitated SLC7A11-mediated cystine import and glutathione peroxidase 4 (GPX4) activity to prevent ferroptosis. By comparison, B-cells were sensitized to ferroptosis induction by combinatorial CD40-ligand and interleukin-4 stimulation or anti-B-cell receptor and Toll-like receptor 9 stimulation upon GPX4 inhibition, but not with SLC7A11 blockade. EBV transforming B-cells became progressively resistant to ferroptosis induction upon switching to the latency III program and lymphoblastoid physiology. Similarly, latency I Burkitt cells were particularly vulnerable to blockade of SLC7A11 or GPX4 or cystine withdrawal, while latency III Burkitt and lymphoblastoid cells were comparatively resistant. The selenocysteine biosynthesis kinase PSTK was newly implicated as a cellular target for ferroptosis induction including in Burkitt cells, likely due to roles in GPX4 biosynthesis. These results highlight ferroptosis as an intriguing therapeutic target for the prevention or treatment of particular EBV-driven B-cell malignancies. Significance EBV contributes to B-cell Burkitt and post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). EBV transforming programs activate lipid metabolism to convert B-cells into immortalized lymphoblastoid cell lines (LCL), a PTLD model. We found that stages of EBV transformation generate lipid reactive oxygen species (ROS) byproducts to varying degrees, and that a Burkitt-like phase of B-cell outgrowth is dependent on lipid ROS detoxification by glutathione peroxidase 4 and its cofactor glutathione. Perturbation of this redox defense in early stages of B-cell transformation or in Burkitt cells triggered ferroptosis, a programmed cell death pathway. LCLs were less dependent on this defense, a distinction tied to EBV latency programs. This highlights ferroptosis induction as a novel therapeutic approach for prevention or treatment of EBV+ lymphomas.

ABSTRACT Epstein–Barr virus (EBV) establishes persistent infection, causes infectious mononucleosis, is a major trigger for multiple sclerosis and contributes to multiple cancers. Yet, knowledge remains incomplete about how the virus remodels host B cells to support lytic replication. We previously identified that EBV lytic replication results in selective depletion of plasma membrane B-cell receptor (BCR) complexes, comprised of immunoglobulin and the CD79A and CD79B signaling chains. Here, we used proteomic and biochemical approaches to identify that the EBV early lytic protein BALF0/1 is responsible for EBV lytic cycle BCR degradation. Mechanistically, an immunoglobulin heavy chain cytoplasmic tail KVK motif was required for ubiquitin-mediated BCR degradation, while CD79A and CD79B were dispensable. BALF0/1 subverted caveolin-mediated endocytosis to internalize plasma membrane BCR complexes and to deliver them to the endoplasmic reticulum. BALF0/1 stimulated immunoglobulin heavy chain cytoplasmic tail ubiquitination, which together with the ATPase valosin-containing protein/p97 drove ER-associated degradation of BCR complexes by cytoplasmic proteasomes. BALF0/1 knockout reduced the viral load of secreted EBV particles from B-cells that expressed a monoclonal antibody against EBV glycoprotein 350 and increased viral particle immunoglobulin incorporation. Consistent with downmodulation of plasma membrane BCR, BALF0/1 overexpression reduced viability of a diffuse large B-cell lymphoma cell line dependent upon BCR signaling. Collectively, our results suggest that EBV BALF0/1 downmodulates immunoglobulin upon lytic reactivation to block BCR signaling and support virion release. SIGNIFICANCE EBV uses a biphasic lifecycle, in which it switches between a latent state that facilitates immune evasion and a lytic state, where virion are secreted. However, when EBV infects a B-cell that makes antibody against a virion protein, EBV must have a strategy to escape becoming trapped, since maturing virion and antibody each traffic through the secretory pathway. We identified that an EBV-encoded protein expressed, BALF0/1, associates with and targets immunoglobulin complexes for degradation. Intriguingly, BALF0/1 subverts the caveolin-1 and ERAD pathways to route antibody from the plasma membrane to cytoplasmic proteasomes for degradation. We present evidence that this enhances EBV secretion from cells that produce antibody against a viral glycoprotein, which could otherwise trap virus.

ABSTRACT Epstein-Barr virus (EBV) infects 95% of adults worldwide and causes infectious mononucleosis. EBV is associated with endemic Burkitt lymphoma, Hodgkin lymphoma, post-transplant lymphomas, nasopharyngeal and gastric carcinomas. In these cancers and in most infected B-cells, EBV maintains a state of latency, where nearly 80 lytic cycle antigens are epigenetically suppressed. To gain insights into host epigenetic factors necessary for EBV latency, we recently performed a human genome-wide CRISPR screen that identified the chromatin assembly factor CAF1 as a putative Burkitt latency maintenance factor. CAF1 loads histones H3 and H4 onto newly synthesized host DNA, though its roles in EBV genome chromatin assembly are uncharacterized. Here, we identified that CAF1 depletion triggered lytic reactivation and transforming virion secretion from Burkitt cells, despite strongly also inducing interferon stimulated genes. CAF1 perturbation diminished occupancy of histones 3.1, 3.3 and repressive H3K9me3 and H3K27me3 marks at multiple viral genome lytic cycle regulatory elements. Suggestive of an early role in establishment of latency, EBV strongly upregulated CAF1 expression in newly infected primary human B-cells prior to the first mitosis, and histone 3.1 and 3.3 were loaded on the EBV genome by this timepoint. Knockout of CAF1 subunit CHAF1B impaired establishment of latency in newly EBV-infected Burkitt cells. A non-redundant latency maintenance role was also identified for the DNA synthesis-independent histone 3.3 loader HIRA. Since EBV latency also requires histone chaperones ATRX and DAXX, EBV coopts multiple host histone pathways to maintain latency, and these are potential targets for lytic induction therapeutic approaches. IMPORTANCE Epstein-Barr virus (EBV) was discovered as the first human tumor virus in endemic Burkitt lymphoma, the most common childhood cancer in sub-Saharan Africa. In Burkitt lymphoma and in 200,000 EBV-associated cancers per year, epigenetic mechanisms maintain viral latency, where lytic cycle factors are silenced. This property complicated EBV’s discovery and facilitates tumor immunoevasion. DNA methylation and chromatin-based mechanisms contribute to lytic gene silencing. Here, we identify histone chaperones CAF1 and HIRA, which have key roles in host DNA replication-dependent and replication independent pathways, respectively, are each important for EBV latency. EBV strongly upregulates CAF1 in newly infected B-cells, where viral genomes acquire histone 3.1 and 3.3 variants prior to the first mitosis. Since histone chaperones ATRX and DAXX also function in maintenance of EBV latency, our results suggest that EBV coopts multiple histone pathways to reprogram viral genomes and highlights targets for lytic induction therapeutic strategies.

ABSTRACT The Epstein Barr virus (EBV) infects almost 95% of the population worldwide. While typically asymptomatic, EBV latent infection is associated with several malignancies of epithelial and lymphoid origin in immunocompromised individuals. In latently infected cells, the EBV genome persists as a chromatinized episome that expresses a limited set of viral genes in different patterns, referred to as latency types, which coincide with varying stages of infection and various malignancies. We have previously demonstrated that latency types correlate with differences in the composition and structure of the EBV episome. Several cellular factors, including the nuclear lamina, regulate chromatin composition and architecture. While the interaction of the viral genome with the nuclear lamina has been studied in the context of EBV lytic reactivation, the role of the nuclear lamina in controlling EBV latency has not been investigated. Here, we report that the nuclear lamina is an essential epigenetic regulator of the EBV episome. We observed that in B cells, EBV infection affects the composition of the nuclear lamina by inducing the expression of lamin A/C, but only in EBV+ cells expressing the Type III latency program. Using ChIP-Seq, we determined that lamin B1 and lamin A/C bind the EBV genome, and their binding correlates with deposition of the histone repressive mark H3K9me2. By RNA-Seq, we observed that knock-out of lamin A/C in B cells alters EBV gene expression. Our data indicate that the interaction between lamins and the EBV episome contributes to the epigenetic control of viral gene expression during latency, suggesting a restrictive function of the nuclear lamina as part of the host response against viral DNA entry into the nucleus. AUTHOR SUMMARY Epstein-Barr virus (EBV) is a common herpesvirus that establishes a lifelong latent infection in a small fraction of B cells of the infected individuals. In most cases, EBV infection is asymptomatic; however, especially in the context of immune suppression, EBV latent infection is associated with several malignancies. In EBV+ cancer cells, latent viral gene expression plays an essential role in sustaining the cancer phenotype. We and others have established that epigenetic modifications of the viral genome are critical to regulating EBV gene expression during latency. Understanding how the EBV genome is epigenetically regulated during latent infection may help identify new specific therapeutic targets for treating EBV+ malignancies. The nuclear lamina is involved in regulating the composition and structure of the cellular chromatin. In the present study, we determined that the nuclear lamina binds the EBV genome during latency, influencing viral gene expression. Depleting one component of the nuclear lamina, lamin A/C, increased the expression of latent EBV genes associated with cellular proliferation, indicating that the binding of the nuclear lamina with the viral genome is essential to control viral gene expression in infected cells. Our data show for the first time that the nuclear lamina may be involved in the cellular response against EBV infection by restricting viral gene expression.

Abstract Epstein-Barr virus (EBV) persistently infects 95% of adults worldwide and is associated with multiple human lymphomas that express characteristic EBV latency programs used by the virus to navigate the B-cell compartment. Upon primary infection, the EBV latency III program, comprised of six Epstein-Barr Nuclear Antigens (EBNA) and two Latent Membrane Protein (LMP) antigens, drives infected B-cells into germinal center (GC). By incompletely understood mechanisms, GC microenvironmental cues trigger the EBV genome to switch to the latency II program, comprised of EBNA1, LMP1 and LMP2A and observed in GC-derived Hodgkin lymphoma. To gain insights into pathways and epigenetic mechanisms that control EBV latency reprogramming as EBV-infected B-cells encounter microenvironmental cues, we characterized GC cytokine effects on EBV latency protein expression and on the EBV epigenome. We confirmed and extended prior studies highlighting GC cytokine effects in support of the latency II transition. The T-follicular helper cytokine interleukin 21 (IL-21), which is a major regulator of GC responses, and to a lesser extent IL-4 and IL-10, hyper-induced LMP1 expression, while repressing EBNA expression. However, follicular dendritic cell cytokines including IL-15 and IL-27 downmodulate EBNA but not LMP1 expression. CRISPR editing highlighted that STAT3 and STAT5 were necessary for cytokine mediated EBNA silencing via epigenetic effects at the EBV genomic C promoter. By contrast, STAT3 was instead necessary for LMP1 promoter epigenetic remodeling, including gain of activating histone chromatin marks and loss of repressive polycomb repressive complex silencing marks. Thus, EBV has evolved to coopt STAT signaling to oppositely regulate the epigenetic status of key viral genomic promoters in response to GC cytokine cues. Author Summary A longstanding question has remained how Epstein-Barr virus (EBV) epigenetically switches between latency programs as it navigates the B-cell compartment. EBV uses its latency III program to stimulate newly infected B cell growth and then trafficking into secondary lymphoid tissue germinal centers (GC). In latency III, the viral C promoter stimulates expression of six Epstein-Barr nuclear antigens (EBNA) that in turn induce two latent membrane proteins (LMP). However, knowledge has remained incomplete about how GC microenvironmental cues trigger switching to latency II, where only one EBNA and two LMP are expressed, a program observed in Hodgkin lymphoma. Building on prior evidence that GC cytokines are a major cue, we systematically tested effects of cytokines secreted by GC-resident T follicular helper and follicular dendritic cells on EBV latency gene expression and on epigenetic remodeling of their promoters. This highlighted that a range of GC cytokines repress latency III EBNA, while only several support LMP1 expression, major events in the transition between the latency III and II programs. We identified key downstream roles of JAK/STAT signaling in relaying cytokine signals to the EBV epigenome, including obligatory STAT3 and 5 roles in rewiring of C and LMP promoter histone epigenetic marks.