The expansion of genomic resources for Atlantic salmon over the past half decade has enabled efficient interrogation of genetic traits by large-scale correlation of genotype to phenotype. Moving from correlation to causation will require genotype-phenotype relationships to be tested experimentally in a cost-efficient and cell context relevant manner. To enable such future experiments, we have developed a method for the isolation and genetic manipulation of primary hepatocytes from Atlantic salmon for use in heterologous expression, reporter assay, and gene editing experiments. We chose the liver as the tissue of interest because it is the metabolic hub and many current Atlantic salmon research projects focus on understanding metabolic processes to improve traits such as growth rate, total fat content, and omega-3 content. We find that isolated primary hepatocytes are optimally transfected with both plasmid and ribonucleoprotein using a Neon electroporator at 1400 V, 10 ms, and 2 pulses. Transfection efficiency with plasmid and cutting efficiency with ribonucleoprotein was optimally 46% and 60%, respectively. We also demonstrate a 26-fold increase in luciferase expression under the promoter of the key liver metabolic gene, elovl5b, compared to empty vector, in line with expected liver-specific expression. Taken together, this work provides a valuable resource enabling transfection and gene editing experiments in a context relevant and cost-effective system.

Abstract Background Two of the most potent drivers of genome evolution in eukaryotes are whole genome duplications (WGD) and transposable element (TE) activity. These two mutational forces can also play synergistic roles; WGDs result in both cellular stress and functional redundancy, which would allow TEs to escape host-silencing mechanisms and effectively spread with reduced impact on fitness. As TEs can function as, or evolve into, TE-derived cis-regulatory elements (TE-CREs), bursts of TE-activity following WGD are likely to impact evolution of gene regulation. However, the role of TEs in genome regulatory remodelling after WGDs is unclear. Here we used the genome of Atlantic salmon, which is known to have experienced massive expansion of TEs after a WGD ∼100 Mya, as a model system to explore the synergistic roles of TEs and WGDs on genome regulatory evolution. Results We identified 61,309 putative TE-CREs in Atlantic salmon using chromatin accessibility data from brain and liver. Of these, 82% were tissue specific to liver (43%) or brain (39%) and TE-CREs originating from retroelements were twice as common as those originating from DNA elements. Signatures of selection shaping TE-CRE evolution were evident from depletion of TEs in open chromatin, a bias in tissue-shared TE-CREs towards older TE-insertions, as well as tissue-specific processes shaping the TE-CRE repertoire. The DTT elements (Tc1-Mariners), which exploded in numbers at the time of the WGD, were significantly less prone to evolve into TE-CREs and significantly less potent in driving or repressing transcription compared to other TE-derived sequences. A minority of TEs (16% of consensus TEs) accounted for the origin of 46% of all TE-CREs, but these ‘CRE-superspreaders’ were not temporally associated with the WGD. Rather, the majority of TE-CREs, including those found to be significantly associated with gene regulatory evolution and thus found to drive or repress transcription, evolved from TE activity occurring across tens of millions of years following the WGD event. Conclusion Our results do not support a WGD-associated TE-CRE rewiring of gene regulation. Instead we find that TEs from diverse superfamilies have been particularly effective in spreading TE-CREs and shaping gene regulatory networks under tissue-specific selection pressures, across millions of years following the salmonid WGD.

The Anopheles gambiae sensu lato species complex consists of a number of cryptic species with different habitats and behaviours. These morphologically indistinct species are identified by chromosome banding and molecular diagnostic techniques which are still under improvement even though the current SINE method for identification between An. coluzzii and An. gambiae works reliably. This study describes a refinement of the SINE method to increase sensitivity and high throughput method for the identification of both species and An. arabiensis using amplicon dissociation characteristics. Field collected samples, laboratory reared colonies and crossed specimens of the two species were used for the design of the protocol. An. gambiae, An. coluzzii, and hybrids of the two species were provided by the insectary of Vestergaard-NMIMR Vector Labs at the Noguchi Memorial Institute for Medical Research (Ghana) and An. arabiensis from Kenya. Samples were first characterised using conventional SINE PCR method, and further assayed using SYBR green, an intercalating fluorescent dye. The three species and hybrids were clearly differentiated using the melting temperature of the dissociation curves, with derivative peaks at 72 degree Celsius for An. arabiensis, 75 degree Celsius for An. gambiae and 86 degree Celsius for An. coluzzii. The hybrids (An. gambiae / An. coluzzii) showed both peaks. This work is the first to describe a SYBR green real time PCR method for the characterization of An. arabiensis, An. gambiae and An. coluzzii and was purposely designed for basic melt-curve analysis (rather than high-resolution melt-curve) to allow it to be used on a wide range of real-time PCR machines.

Abstract Background Transposable elements (TEs) are hypothesized to play important roles in shaping genome evolution following whole genome duplications (WGD), including rewiring of gene regulation. In a recent analysis, duplicate gene copies that had evolved higher expression in liver following the salmonid WGD ~100 million years ago were associated with higher numbers of predicted TE-derived cis -regulatory elements (TE-CREs). Yet, the ability of these TE-CREs to recruit transcription factors (TFs) in vivo and impact gene expression remains unknown. Results Here, we evaluated the gene regulatory functions of 11 TEs using luciferase promoter reporter assays in Atlantic salmon ( Salmo salar ) primary liver cells. Canonical Tc1- Mariner elements from intronic regions showed no or small repressive effects on transcription. However, other TE-derived cis -regulatory elements upstream of transcriptional start sites increased expression significantly. Conclusion Our results question the hypothesis that TEs in the Tc1- Mariner superfamily, which were extremely active following WGD in salmonids, had a major impact on regulatory rewiring of gene duplicates, but highlights the potential of other TEs in post-WGD rewiring of gene regulation in the Atlantic salmon genome.

With declining wild fish populations, farmed Atlantic salmon (Salmo salar) has gained popularity as a source for healthy long-chain highly unsaturated fatty acids (LC-HUFA) including 20:5n-3 and 22:6n-3. However, the introduction of plant-based oil in fish diets has reduced the content of these beneficial LC-HUFA. The capability of biosynthesis of LC-HUFAs depends on fatty acids supplied in diets and the genetic potential residing in the fish. Key proteins involved in LC-HUFA synthesis in salmon include fatty acid desaturases 2 (Fads2). In a recent study we used CRISPR/Cas9 to generate two F0 mutant strains of salmon, 1) Δ6abc/5Mt with mutations in Δ5fads2, Δ6fads2-a, Δ6fads2-b and Δ6fads2-c genes, and 2) Δ6bcMt with mutations in Δ6fads2-b and Δ6fads2-c genes. The CRISPR mutated salmon (crispants) had reduced levels of LC-HUFA and expression of targeted fads2 genes. In present study we apply whole transcriptome analysis on these fads2 crispants. Our purpose is to evaluate the genetic mosaicism in fads2 crispants and the effect these mutations had on other lipid metabolism pathways in fish. Both Δ6abc/5Mt and Δ6bcMt crispants demonstrated high percentage of indels within all intended target genes, though different indel types and percentage were observed between individuals. Skipping of a CRISPR-targeted exon was observed in Δ6fads2-a gene of Δ6abc/5Mt salmon. The Δ6abc/5Mt fish also displayed several disruptive indels which resulted in over 100 differentially expressed genes (DEGs) enriched in lipid metabolism pathways in liver. This includes up-regulation of srebp1 genes as well as genes involved in fatty acid de-novo synthesis, fatty acid β-oxidation and lipogenesis. Both elovl5 and elovl2 genes were not changed, suggesting that the genes were not targeted by Srebp1. The mutation of Δ6bcMt surprisingly resulted in over 3000 DEGs which were enriched in factors encoding genes involved in mRNA regulation and stability.