Significance Cas9, a protein derived from the bacterial CRISPR/Cas9 immune system, relies on a programmable single-guide RNA (sgRNA) to bind specific genomic sequences. Cas9 complexed with sgRNA readily binds on-target DNA, but models that can predict the specificity of this process have proven elusive. To investigate this system from a biophysical perspective, we applied a massively parallel method for profiling protein–DNA interactions to quantify nuclease-dead Cas9 (dCas9) binding across thousands of off-target sequences. We observe that mismatches at certain positions of the guide lead to complex dCas9 dissociation patterns, and multiple mismatches between the gRNA and DNA at nonseed bases can produce substantial changes in observed association and dissociation, suggesting the possibility of kinetic and thermodynamic tuning of Cas9 behavior.

ABSTRACT Designing single molecules that compute general functions of input molecular partners represents a major unsolved challenge in molecular design. Here, we demonstrate that high-throughput, iterative experimental testing of diverse RNA designs crowdsourced from Eterna yields sensors of increasingly complex functions of input oligonucleotide concentrations. After designing single-input RNA sensors with activation ratios beyond our detection limits, we created logic gates, including challenging XOR and XNOR gates, and sensors that respond to the ratio of two inputs. Finally, we describe the OpenTB challenge, which elicited 85-nucleotide sensors that compute a score for diagnosing active tuberculosis, based on the ratio of products of three gene segments. Building on OpenTB design strategies, we created an algorithm Nucleologic that produces similarly compact sensors for the three-gene score based on RNA and DNA. These results open new avenues for diverse applications of compact, single molecule sensors previously limited by design complexity.

The bacterial adaptive immune system CRISPR-Cas9 has been appropriated as a versatile tool for editing genomes, controlling gene expression, and visualizing genetic loci. To analyze Cas9′s ability to bind DNA rapidly and specifically, we measured the kinetics of catalytically dead Cas9 (dCas9) interactions with a library of potential binding partners. Using a massively parallel assay of protein-DNA interactions derived from a high-throughput sequencing flow cell (HiTS-FLIP) and building on the established importance of protospacer adjacent motif (PAM) and seed recognition, we identify two PAM-distal regions, proximal and distal to the seed region, with distinct behaviors: multiple mismatches in the seed-proximal region work in a highly synergistic manner to reduce Cas9 association whereas seemingly tolerated mismatches in the distal region precipitate comparatively rapid dissociation of Cas9. Together, these observations support a model for Cas9 specificity wherein gRNA-DNA mismatches at distinct domains of PAM-distal bases modulate different biophysical parameters of association and dissociation, opening the possibility of kinetic and thermodynamic tuning of the Cas9-DNA interaction and quantitative prediction of off-target binding behaviors.

Internet-based scientific communities promise a means to apply distributed, diverse human intelligence towards previously intractable scientific problems. However, current implementations have not allowed communities to propose experiments to test all emerging hypotheses at scale or to modify hypotheses in response to experiments. We report high-throughput methods for molecular characterization of nucleic acids that enable the large-scale videogame-based crowdsourcing of functional RNA sensor design, followed by high-throughput functional characterization. Iterative design testing of thousands of crowdsourced RNA sensor designs produced near-thermodynamically optimal and reversible RNA switches that act as self-contained molecular sensors and couple five distinct small molecule inputs to three distinct protein binding and fluorogenic outputs - results that surpass computational and expert-based design. This work represents a new paradigm for widely distributed experimental bioscience.

RNA is a functionally versatile molecule that plays key roles in genetic regulation and in emerging technologies to control biological processes. Computational models of RNA secondary structure are well-developed but often fall short in making quantitative predictions of the behavior of multi-RNA complexes. Recently, large datasets characterizing hundreds of thousands of individual RNA complexes have emerged as rich sources of information about RNA energetics. Meanwhile, advances in machine learning have enabled the training of complex neural networks from large datasets. Here, we assess whether a recurrent neural network model, Ribonet, can learn from high-throughput binding data, using simulation and experimental studies to test model accuracy but also determine if they learned meaningful information about the biophysics of RNA folding. We began by evaluating the model on energetic values predicted by the Turner model to assess whether the neural network could learn a representation that recovered known biophysical principles. First, we trained Ribonet to predict the simulated free energy of an RNA in complex with multiple input RNAs. Our model accurately predicts free energies of new sequences but also shows evidence of having learned base pairing information, as assessed by in silico double mutant analysis. Next, we extended this model to predict the simulated affinity between an arbitrary RNA sequence and a reporter RNA. While these more indirect measurements precluded the learning of basic principles of RNA biophysics, the resulting model achieved sub-kcal/mol accuracy and enabled design of simple RNA input responsive riboswitches with high activation ratios predicted by the Turner model from which the training data were generated. Finally, we compiled and trained on an experimental dataset comprising over 600,000 experimental affinity measurements published on the Eterna open laboratory. Though our tests revealed that the model likely did not learn a physically realistic representation of RNA interactions, it nevertheless achieved good performance of 0.76 kcal/mol on test sets with the application of transfer learning and novel sequence-specific data augmentation strategies. These results suggest that recurrent neural network architectures, despite being naïve to the physics of RNA folding, have the potential to capture complex biophysical information. However, more diverse datasets, ideally involving more direct free energy measurements, may be necessary to train de novo predictive models that are consistent with the fundamentals of RNA biophysics.

Riboswitches that couple binding of ligands to recruitment of molecular machines offer sensors and control elements for RNA synthetic biology and medical biotechnology. Current approaches to riboswitch design enable significant changes in output activity in the presence vs. absence of input ligands. However, design of these riboswitches has so far required expert intuition and explicit specification of complete target secondary structures, both of which limit the structure-toggling mechanisms that have been explored. We present a fully automated method called RiboLogic for these design tasks and high-throughput experimental tests of 2,875 molecules using RNA-MaP (RNA on a massively parallel array) technology. RiboLogic designs explore an unprecedented diversity of structure-toggling mechanisms validated through experimental tests. These synthetic molecules consistently modulate their affinity to the MS2 bacteriophage coat protein upon binding of flavin mononucleotide, tryptophan, theophylline, and microRNA miR-208a, achieving activation ratios of up to 20 and significantly better performance than control designs. The data enable dissection of features of structure-toggling mechanisms that correlate with higher performance. The diversity of RiboLogic designs and their quantitative experimental characterization provides a rich resource for further improvement of riboswitch models and design methods.

High-throughput methodologies have enabled routine generation of RNA target sets and sequence motifs for RNA-binding proteins (RBPs). Nevertheless, quantitative approaches are needed to capture the landscape of RNA/RBP interactions responsible for cellular regulation. We have used the RNA-MaP platform to directly measure equilibrium binding for thousands of designed RNAs and to construct a predictive model for RNA recognition by the human Pumilio proteins PUM1 and PUM2. Despite prior findings of linear sequence motifs, our measurements revealed widespread residue flipping and instances of positional coupling. Application of our thermodynamic model to published in vivo crosslinking data reveals quantitative agreement between predicted affinities and in vivo occupancies. Our analyses suggest a thermodynamically driven, continuous Pumilio binding landscape that is negligibly affected by RNA structure or kinetic factors, such as displacement by ribosomes. This work provides a quantitative foundation for dissecting the cellular behavior of RBPs and cellular features that impact their occupancies.