A monoclonal antibody (mAb) was isolated that blocked the binding and bioactivity of both human and murine interleukin 1β (IL-1β) on murine IL-1 receptor-bearing cells. This mAb recognized a protein that was distinct from the Type I and Type II IL-1 receptors, suggesting that an additional protein exists that is involved in IL-1 biological responses. By expression cloning in COS-7 cells, we have isolated a cDNA from mouse 3T3-LI cells encoding this putative auxiliary molecule, which we term the IL-1 receptor accessory protein (IL-1R AcP). Sequence analysis of the cDNA predicts an open reading frame that encodes a 570-amino acid protein with a molecular mass of ~66 kDa. The IL-1R AcP is a member of the Ig superfamily by analysis of its putative extracellular domain and also bears limited homology throughout the protein to both Type I and Type II IL-1 receptors. Northern analysis reveals that murine IL-1R AcP mRNA is expressed in many tissues and appears to be regulated by IL-1. In mammalian cells expressing natural or recombinant Type I IL-1R and IL-1R AcP, the accessory protein forms a complex with the Type I IL-1R and either IL-1α or IL-1β but not IL-1ra. The recombinant accessory protein also increases the binding affinity of the recombinant Type I IL-1R for IL-1β when the two receptor proteins are coexpressed. Therefore, the functional IL-1 receptor appears to be a complex composed of at least two subunits. A monoclonal antibody (mAb) was isolated that blocked the binding and bioactivity of both human and murine interleukin 1β (IL-1β) on murine IL-1 receptor-bearing cells. This mAb recognized a protein that was distinct from the Type I and Type II IL-1 receptors, suggesting that an additional protein exists that is involved in IL-1 biological responses. By expression cloning in COS-7 cells, we have isolated a cDNA from mouse 3T3-LI cells encoding this putative auxiliary molecule, which we term the IL-1 receptor accessory protein (IL-1R AcP). Sequence analysis of the cDNA predicts an open reading frame that encodes a 570-amino acid protein with a molecular mass of ~66 kDa. The IL-1R AcP is a member of the Ig superfamily by analysis of its putative extracellular domain and also bears limited homology throughout the protein to both Type I and Type II IL-1 receptors. Northern analysis reveals that murine IL-1R AcP mRNA is expressed in many tissues and appears to be regulated by IL-1. In mammalian cells expressing natural or recombinant Type I IL-1R and IL-1R AcP, the accessory protein forms a complex with the Type I IL-1R and either IL-1α or IL-1β but not IL-1ra. The recombinant accessory protein also increases the binding affinity of the recombinant Type I IL-1R for IL-1β when the two receptor proteins are coexpressed. Therefore, the functional IL-1 receptor appears to be a complex composed of at least two subunits.

ABSTRACT VCAM-1 is a cytokine-inducible cell surface protein capable of mediating adhesion to leukocytes expressing α4 integrins. Mice deficient in VCAM-1 expression were produced by targeted homologous recombination in ES cells. VCAM-1-deficient embryos were not viable and exhibited either of two distinct phenotypes. Approximately half of the embryos died before embryonic day 11.5 and exhibited a severe defect in placental development in which the allantois failed to fuse with the chorion. The remaining VCAM-1-deficient embryos survived to embryonic day 11.5-12.5 and displayed several abnormalities in their developing hearts including a reduction of the compact layer of the ventricular myocardium and intraventricular septum. The hearts also contained significant amounts of blood in the pericardial space and lacked an epicardium. α4 and VCAM-1 were found to be expressed in wild-type embryos in a reciprocal fashion in the chorion and allantois and in the epicardium and the underlying myocardium, although VCAM-1 was expressed in the intraventricular septum in the absence of adjacent α4-expressing cells. These data suggest important roles for VCAM-1 and α4 in the development of the placenta and the heart.

The initial rolling interaction of leukocytes with the blood vessel wall during leukocyte trafficking has been postulated to rely on members of the selectin family of adhesion molecules. Two selectins, E-selectin and P-selectin, have been identified that are expressed on activated endothelial cells. Mice deficient in E-selectin expression have been produced in order to examine the role of this selectin in leukocyte trafficking. Mice homozygous for an E-selectin null mutation were viable and exhibited no obvious developmental alterations. E-selectin-deficient mice displayed no significant change in the trafficking of neutrophils in several models of inflammation. However, blocking both endothelial selectins by treatment of the E-selectin-deficient animals with an anti-murine P-selectin antibody, 5H1, significantly inhibited neutrophil emigration in two distinct models of inflammation. While neutrophil accumulation at early times during thioglycollate-induced peritonitis was dependent on P-selectin, neutrophil accumulation at later time points was blocked by 5H1 only in E-selectin-deficient mice but not in wild-type mice. Similarly, edema as well as leukocyte accumulation in a model of delayed-type hypersensitivity in the skin was almost completely prevented by blockade of P-selectin function with 5H1 in the E-selectin-deficient mice while the same treatment had no effect in wild-type mice. These data demonstrate that the majority of neutrophil migration in both models requires an endothelial selectin but that E-selectin and P-selectin are functionally redundant. These data have important implications in the use of selectin antagonists in the treatment of inflammatory disease.

High-content screening is transforming drug discovery by enabling simultaneous measurement of multiple features of cellular phenotype that are relevant to therapeutic and toxic activities of compounds. High-content screening studies typically generate immense datasets of image-based phenotypic information, and how best to mine relevant phenotypic data is an unsolved challenge. Here, we introduce factor analysis as a data-driven tool for defining cell phenotypes and profiling compound activities. This method allows a large data reduction while retaining relevant information, and the data-derived factors used to quantify phenotype have discernable biological meaning. We used factor analysis of cells stained with fluorescent markers of cell cycle state to profile a compound library and cluster the hits into seven phenotypic categories. We then compared phenotypic profiles, chemical similarity and predicted protein binding activities of active compounds. By integrating these different descriptors of measured and potential biological activity, we can effectively draw mechanism-of-action inferences.

The calcium-activated chloride channel anoctamin 1 ( ANO1 ) is located within the 11q13 amplicon, one of the most frequently amplified chromosomal regions in human cancer, but its functional role in tumorigenesis has remained unclear. The 11q13 region is amplified in ∼15% of breast cancers. Whether ANO1 is amplified in breast tumors, the extent to which gene amplification contributes to ANO1 overexpression, and whether overexpression of ANO1 is important for tumor maintenance have remained unknown. We have found that ANO1 is amplified and highly expressed in breast cancer cell lines and primary tumors. Amplification of ANO1 correlated with disease grade and poor prognosis. Knockdown of ANO1 in ANO1-amplified breast cancer cell lines and other cancers bearing 11q13 amplification inhibited proliferation, induced apoptosis, and reduced tumor growth in established cancer xenografts. Moreover, ANO1 chloride channel activity was important for cell viability. Mechanistically, ANO1 knockdown or pharmacological inhibition of its chloride-channel activity reduced EGF receptor (EGFR) and calmodulin-dependent protein kinase II (CAMKII) signaling, which subsequently attenuated AKT, v-src sarcoma viral oncogene homolog (SRC), and extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation in vitro and in vivo. Our results highlight the involvement of the ANO1 chloride channel in tumor progression and provide insights into oncogenic signaling in human cancers with 11q13 amplification, thereby establishing ANO1 as a promising target for therapy in these highly prevalent tumor types.

Summary Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a devastating condition with very limited treatment options. It is a heterogeneous disease with complex genetics and unclear etiology, making the discovery of disease-modifying interventions very challenging. To discover novel mechanisms underlying ALS, we leverage a unique platform that combines isogenic, induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived models of disease-causing mutations with rich phenotyping via high-content imaging and deep learning models. We introduced eight mutations that cause familial ALS (fALS) into multiple donor iPSC lines, and differentiated them into motor neurons to create multiple isogenic pairs of healthy (wild-type) and sick (mutant) motor neurons. We collected extensive high-content imaging data and used machine learning (ML) to process the images, segment the cells, and learn phenotypes. Self-supervised ML was used to create a concise embedding that captured significant, ALS-relevant biological information in these images. We demonstrate that ML models trained on core cell morphology alone can accurately predict TDP-43 mislocalization, a known phenotypic feature related to ALS. In addition, we were able to impute RNA expression from these image embeddings, in a way that elucidates molecular differences between mutants and wild-type cells. Finally, predictors leveraging these embeddings are able to distinguish between mutant and wild-type both within and across donors, defining cellular, ML-derived disease models for diverse fALS mutations. These disease models are the foundation for a novel screening approach to discover disease-modifying targets for familial ALS.