Agonist-induced activation of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) is known to cause adipocyte differentiation and insulin sensitivity. The biological role of PPARγ was investigated by gene targeting. Homozygous PPARγ-deficient embryos died at 10.5–11.5 dpc due to placental dysfunction. Quite unexpectedly, heterozygous PPARγ-deficient mice were protected from the development of insulin resistance due to adipocyte hypertrophy under a high-fat diet. These phenotypes were abrogated by PPARγ agonist treatment. Heterozygous PPARγ-deficient mice showed overexpression and hypersecretion of leptin despite the smaller size of adipocytes and decreased fat mass, which may explain these phenotypes at least in part. This study reveals a hitherto unpredicted role for PPARγ in high-fat diet–induced obesity due to adipocyte hypertrophy and insulin resistance, which requires both alleles of PPARγ.

Current genome-wide association studies do not yet capture sufficient diversity in populations and scope of phenotypes. To expand an atlas of genetic associations in non-European populations, we conducted 220 deep-phenotype genome-wide association studies (diseases, biomarkers and medication usage) in BioBank Japan (n = 179,000), by incorporating past medical history and text-mining of electronic medical records. Meta-analyses with the UK Biobank and FinnGen (ntotal = 628,000) identified ~5,000 new loci, which improved the resolution of the genomic map of human traits. This atlas elucidated the landscape of pleiotropy as represented by the major histocompatibility complex locus, where we conducted HLA fine-mapping. Finally, we performed statistical decomposition of matrices of phenome-wide summary statistics, and identified latent genetic components, which pinpointed responsible variants and biological mechanisms underlying current disease classifications across populations. The decomposed components enabled genetically informed subtyping of similar diseases (for example, allergic diseases). Our study suggests a potential avenue for hypothesis-free re-investigation of human diseases through genetics. Genome-wide analyses in BioBank Japan, UK Biobank and FinnGen identify ~5,000 new loci associated with 220 human traits. Statistical decomposition of matrices of phenome-wide summary statistics further highlights variants underpinning diseases across populations.

Adiponectin is an adipocyte-derived hormone, which has been shown to play important roles in the regulation of glucose and lipid metabolism. Eight mutations in human adiponectin have been reported, some of which were significantly related to diabetes and hypoadiponectinemia, but the molecular mechanisms of decreased plasma levels and impaired action of adiponectin mutants were not clarified. Adiponectin structurally belongs to the complement 1q family and is known to form a characteristic homomultimer. Herein, we demonstrated that simple SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions clearly separates multimer species of adiponectin. Adiponectin in human or mouse serum and adiponectin expressed in NIH-3T3 or Escherichia coli formed a wide range of multimers from trimers to high molecular weight (HMW) multimers. A disulfide bond through an amino-terminal cysteine was required for the formation of multimers larger than a trimer. An amino-terminal Cys-Ser mutation, which could not form multimers larger than a trimer, abrogated the effect of adiponectin on the AMP-activated protein kinase pathway in hepatocytes. Among human adiponectin mutations, G84R and G90S mutants, which are associated with diabetes and hypoadiponectinemia, did not form HMW multimers. R112C and I164T mutants, which are associated with hypoadiponectinemia, did not assemble into trimers, resulting in impaired secretion from the cell. These data suggested impaired multimerization and/or the consequent impaired secretion to be among the causes of a diabetic phenotype or hypoadiponectinemia in subjects having these mutations. In conclusion, not only total concentrations, but also multimer distribution should always be considered in the interpretation of plasma adiponectin levels in health as well as various disease states. Adiponectin is an adipocyte-derived hormone, which has been shown to play important roles in the regulation of glucose and lipid metabolism. Eight mutations in human adiponectin have been reported, some of which were significantly related to diabetes and hypoadiponectinemia, but the molecular mechanisms of decreased plasma levels and impaired action of adiponectin mutants were not clarified. Adiponectin structurally belongs to the complement 1q family and is known to form a characteristic homomultimer. Herein, we demonstrated that simple SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions clearly separates multimer species of adiponectin. Adiponectin in human or mouse serum and adiponectin expressed in NIH-3T3 or Escherichia coli formed a wide range of multimers from trimers to high molecular weight (HMW) multimers. A disulfide bond through an amino-terminal cysteine was required for the formation of multimers larger than a trimer. An amino-terminal Cys-Ser mutation, which could not form multimers larger than a trimer, abrogated the effect of adiponectin on the AMP-activated protein kinase pathway in hepatocytes. Among human adiponectin mutations, G84R and G90S mutants, which are associated with diabetes and hypoadiponectinemia, did not form HMW multimers. R112C and I164T mutants, which are associated with hypoadiponectinemia, did not assemble into trimers, resulting in impaired secretion from the cell. These data suggested impaired multimerization and/or the consequent impaired secretion to be among the causes of a diabetic phenotype or hypoadiponectinemia in subjects having these mutations. In conclusion, not only total concentrations, but also multimer distribution should always be considered in the interpretation of plasma adiponectin levels in health as well as various disease states. Adiponectin (also known as ACRP30, 1The abbreviations used are: ACRP30, adipocyte complement-related protein of 30kDa; HMW, high molecular weight; GBP28, gelatin binding protein of 28kDa; MMW, middle molecular weight; LMW, low molecular weight; AMPK, AMP-activated protein kinase; DMEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium; ACC, acetyl-CoA carboxylase; TBS, Tris-buffered saline; PBS, phosphate-buffered saline; WT, wild-type; BS3, Bis (sulfosuccimidyl) suberate; SP-A, Surfactant protein-A; SP-D, Surfactant protein-D.1The abbreviations used are: ACRP30, adipocyte complement-related protein of 30kDa; HMW, high molecular weight; GBP28, gelatin binding protein of 28kDa; MMW, middle molecular weight; LMW, low molecular weight; AMPK, AMP-activated protein kinase; DMEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium; ACC, acetyl-CoA carboxylase; TBS, Tris-buffered saline; PBS, phosphate-buffered saline; WT, wild-type; BS3, Bis (sulfosuccimidyl) suberate; SP-A, Surfactant protein-A; SP-D, Surfactant protein-D. GBP28, and AdipoQ) (1Scherer P.E. Williams S. Fogliano M. Baldini G. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26746-26749Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2724) Google Scholar, 2Hu E. Liang P. Spiegelman B.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10697-10703Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1879) Google Scholar, 3Maeda K. Okubo K. Shimomura I. Funahashi T. Matsuzawa Y. Matsubara K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 221: 286-289Crossref PubMed Scopus (1838) Google Scholar, 4Nakano Y. Tobe T. Choi-Miura N.H. Mazda T. Tomita M. J. Biochem. 1996; 120: 803-812Crossref PubMed Scopus (783) Google Scholar) is a hormone secreted exclusively from adipocytes and has been shown to play important roles in the regulation of glucose and lipid metabolism. Adiponectin concentrations are reduced in obese and insulin-resistant human subjects and animal models (2Hu E. Liang P. Spiegelman B.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10697-10703Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1879) Google Scholar, 5Arita Y. Kihara S. Ouchi N. Takahashi M. Maeda K. Miyagawa J. Hotta K. Shimomura I. Nakamura T. Miyaoka K. Kuriyama H. Nishida M. Yamashita S. Okubo K. Matsubara K. Muraguchi M. Ohmoto Y. Funahashi T. Matsuzawa Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 79-83Crossref PubMed Scopus (4039) Google Scholar, 6Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4043) Google Scholar). Genetic deletion of adiponectin in mice (7Kubota N. Terauchi Y. Yamauchi T. Kubota T. Moroi M. Matsui J. Eto K. Yamashita T. Kamon J. Satoh H. Yano W. Froguel P. Nagai R. Kimura S. Kadowaki T. Noda T. J. Biol. Chem. 2002; 277: 25863-25866Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1181) Google Scholar, 8Maeda N. Shimomura I. Kishida K. Nishizawa H. Matsuda M. Nagaretani H. Furuyama N. Kondo H. Takahashi M. Arita Y. Komuro R. Ouchi N. Kihara S. Tochino Y. Okutomi K. Horie M. Takeda S. Aoyama T. Funahashi T. Matsuzawa Y. Nat. Med. 2002; 8: 731-737Crossref PubMed Scopus (1804) Google Scholar) or adiponectin supplementation of an insulin-resistant obese murine model (6Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4043) Google Scholar, 9Berg A.H. Combs T.P. Du X. Brownlee M. Scherer P.E. Nat. Med. 2001; 7: 947-953Crossref PubMed Scopus (2198) Google Scholar), has demonstrated that reduced plasma adiponectin levels caused by genetic or nutritional factors to be one of the important causes of type 2 diabetes development. On the other hand, adiponectin is mapped to chromosome locus 3q27, which is reportedly the locus closely associated with type 2 diabetes based on genome-wide scans in several ethnic groups (10Mori Y. Otabe S. Dina C. Yasuda K. Populaire C. Lecoeur C. Vatin V. Durand E. Hara K. Okada T. Tobe K. Boutin P. Kadowaki T. Froguel P. Diabetes. 2002; 51: 1247-1255Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar, 11Vionnet N. Hani E.H. Dupont S. Gallina S. Francke S. Dotte S. De Matos F. Durand E. Lepretre F. Lecoeur C. Gallina P. Zekiri L. Dina C. Froguel P. Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 1470-1480Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (618) Google Scholar, 12Kissebah A.H. Sonnenberg G.E. Myklebust J. Goldstein M. Broman K. James R.G. Marks J.A. Krakower G.R. Jacob H.J. Weber J. Martin L. Blangero J. Comuzzie A.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 14478-14483Crossref PubMed Scopus (569) Google Scholar). The G allele of single nucleotide polymorphism (SNP) 276 in adiponectin is associated with hypoadiponectinemia and type 2 diabetes (13Hara K. Boutin P. Mori1 Y. Tobe K. Dina C. Yasuda K. Yamauchi T. Otabe S. Okada T. Eto K. Kadowaki H. Hagura R. Akanuma Y. Yazaki Y. Nagai R. Taniyama M. Matsubara K. Yoda M. Nakano Y. Kimura S. Tomita M. Kimura S. Ito C. Froguel P. Kadowaki T. Diabetes. 2002; 51: 536-540Crossref PubMed Scopus (639) Google Scholar). Eight mutations in human adiponectin have been reported (13Hara K. Boutin P. Mori1 Y. Tobe K. Dina C. Yasuda K. Yamauchi T. Otabe S. Okada T. Eto K. Kadowaki H. Hagura R. Akanuma Y. Yazaki Y. Nagai R. Taniyama M. Matsubara K. Yoda M. Nakano Y. Kimura S. Tomita M. Kimura S. Ito C. Froguel P. Kadowaki T. Diabetes. 2002; 51: 536-540Crossref PubMed Scopus (639) Google Scholar, 14Takahashi M. Arita Y. Yamagata K. Matsukawa Y. Okutomi K. Horie M. Shimomura I. Hotta K. Kuriyama H. Kihara S. Nakamura T. Yamashita S. Funahashi T. Matsuzawa Y. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2000; 24: 861-868Crossref PubMed Scopus (325) Google Scholar, 15Kondo H. Shimomura I. Matsukawa Y. Kumada M. Takahashi M. Matsuda M. Ouchi N. Kihara S. Kawamoto T. Sumitsuji S. Funahashi T. Matsuzawa Y. Diabetes. 2002; 51: 2325-2328Crossref PubMed Scopus (342) Google Scholar, 16Vasseur F. Helbecque N. Dina C. Lobbens S. Delannoy V. Gaget S. Boutin P Vaxillaire M. Lepretre F. Dupont S. Hara K. Clement K. Bihain B. Kadowaki T. Froguel P. Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 2607-2614Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar). Several mutations were significantly related to diabetes and hypoadiponectinemia (15Kondo H. Shimomura I. Matsukawa Y. Kumada M. Takahashi M. Matsuda M. Ouchi N. Kihara S. Kawamoto T. Sumitsuji S. Funahashi T. Matsuzawa Y. Diabetes. 2002; 51: 2325-2328Crossref PubMed Scopus (342) Google Scholar, 16Vasseur F. Helbecque N. Dina C. Lobbens S. Delannoy V. Gaget S. Boutin P Vaxillaire M. Lepretre F. Dupont S. Hara K. Clement K. Bihain B. Kadowaki T. Froguel P. Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 2607-2614Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar). Molecular mechanisms underlying the development of diabetes and hypoadiponectinemia have yet to be clarified. Adiponectin structurally belongs to the complement 1q family and consists of a carboxyl-terminal globular domain and an amino-terminal collagenous domain (17Shapiro L. Scherer P.E. Curr. Biol. 1998; 8: 335-338Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 18Yokota T. Oritani K. Takahashi I. Ishikawa J. Matsuyama A. Ouchi N. Kihara S. Funahashi T. Tenner A.J. Tomiyama Y. Matsuzawa Y. Blood. 2000; 96: 1723-1732Crossref PubMed Google Scholar). This family is also known to form characteristic multimers (19Crouch E. Persson A. Chang D. Heuser J. J. Biol. Chem. 1994; 269: 17311-17319Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 20McCormack F.X. Pattanajitvilai S. Stewart J. Possmayer F. Inchley K. Voelker D.R. J. Biol. Chem. 1997; 272: 27971-27979Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (62) Google Scholar). Gel filtration and velocity gradient studies revealed adiponectin circulating in serum to form several different molecular weight species; the largest species was more than several hundred kilodaltons in size (1Scherer P.E. Williams S. Fogliano M. Baldini G. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26746-26749Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2724) Google Scholar, 4Nakano Y. Tobe T. Choi-Miura N.H. Mazda T. Tomita M. J. Biochem. 1996; 120: 803-812Crossref PubMed Scopus (783) Google Scholar, 5Arita Y. Kihara S. Ouchi N. Takahashi M. Maeda K. Miyagawa J. Hotta K. Shimomura I. Nakamura T. Miyaoka K. Kuriyama H. Nishida M. Yamashita S. Okubo K. Matsubara K. Muraguchi M. Ohmoto Y. Funahashi T. Matsuzawa Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 79-83Crossref PubMed Scopus (4039) Google Scholar, 21Tsao T-S. Murrey H.E. Hug C. Lee D.H. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 2002; 277: 29359-29362Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (334) Google Scholar). In this study, we demonstrated that simple SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions clearly separates multimer species of adiponectin. Applying this method, we investigated the molecular structure and mode of multimerization of adiponectin from human or mouse serum and cultured cells. Since we speculated that adiponectin mutations might alter multimer formations of adiponectin, we analyzed these mutants with SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions. We demonstrated impaired multimerization and secretion in these mutants to possibly contribute to the development of diabetes and hypoadiponectinemia. Adiponectin has been shown to be one of the major regulators of energy homeostasis and insulin sensitivity. This study sheds new light on the molecular structure-function relationship. Materials—Trypsin V-S, Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), anti-FLAG M2 antibody cross-linked to agarose, and FLAG peptide were purchased from Sigma. 2-Mercaptoethanol was purchased from Wako Pure Chemicals. Mammalian expression vector pcDNA3.1(+) was purchased from Invitrogen. Prokaryotic expression vector PQE30 and Ni-NTA agarose were purchased from Qiagen. Superdex S300HR 10/30 was purchased from Amersham Biosciences. Anti-phosphorylated AMP-activated protein kinase (AMPK) antibody and anti-phosphorylated acetyl-CoA carboxylase (ACC) antibody were purchased from Cell Signaling. Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody was purchased from Zymed Laboratories Inc.. Cell Culture—NIH-3T3 fibroblasts were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum in an incubator with 5% CO2 at 37 °C. 3T3-L1 adipocytes were maintained as subconfluent cultures in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. 3T3-L1 preadipocytes were differentiated to mature adipocytes by a conventional method (22Miki H. Yamauchi T. Suzuki R. Komeda K. Tsuchida A. Kubota N. Terauchi Y. Kamon J. Kaburagi Y. Matsui J. Akanuma Y. Nagai R. Kimura S. Tobe K. Kadowaki T. Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 2521-2532Crossref PubMed Scopus (170) Google Scholar). Myocyte cell line C2C12 and primary hepatocytes were cultured as described in Ref. 23Yamauchi T. Kamon J. Minokoshi Y. Ito Y. Waki H. Uchida S. Yamashita S. Noda M. Kita S. Ueki K. Eto K. Akanuma Y. Froguel P. Foufelle F. Ferre P. Carling D. Kimura S. Nagai R. Kahn B.B. Kadowaki T. Nat. Med. 2002; 8: 1288-1295Crossref PubMed Scopus (3419) Google Scholar. Cloning, Recombinant Expression, and Purification of Adiponectin—A murine adiponectin coding sequence (NCBI accession no. U37222) flanked by a Kozak sequence was cloned from mouse white adipose tissue and inserted between EcoRI and NotI in the multiple cloning site of pcDNA3.1(+). Human adiponectin (NCBI accession no. D45371) was also cloned into pcDNA3.1(+) in the same manner. For mammalian expression, NIH-3T3 fibroblasts were transfected with expression vectors using LipofectAMINE (Invitrogen) according to the manufacturer's instruction. For the purification of recombinant adiponectin from NIN-3T3 fibroblast medium, we prepared an expression vector in which the FLAG tag sequence, 5′-GATTACAAGGATGACGACGATAAG-3′ (DYKDDDDK in amino acids) was inserted into the carboxyl terminus of adiponectin. NIH-3T3 fibroblasts were transfected with the FLAG-tagged adiponectin expression vector and recombinant protein was allowed to secrete into the medium for 48 h. Collected medium was applied to an anti-FLAG affinity column. The column was washed with Tris-buffered saline (10 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, pH7.5, TBS) and bound recombinant adiponectin was eluted with FLAG peptide. Adiponectin-rich fractions were collected and dialyzed against TBS. For prokaryotic expression, the coding sequence deprived of the signal sequence (corresponding to residues 18-247) of mouse adiponectin was inserted between BamHI and HindIII of the PQE30 expression vector, which expressed the His6 tag attached to the amino terminus of adiponectin. For the globular domain, the sequence corresponding the residues 104-247 was inserted. Expression and purification of His-tagged adiponectin from the Escherichia coli lysate was performed as described in Ref. 6Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4043) Google Scholar. Briefly, the soluble fraction of the E. coli lysate was applied to Ni-NTA agarose, washed thoroughly and bound adiponectin was eluted stepwise with imidazole. Fractions containing adiponectin was collected and extensively dialyzed against phosphate-buffered saline (PBS). Site-directed Mutagenesis of Adiponectin—Mouse C39S mutant adiponectin was generated using a site-directed mutagenesis kit (Stratagene) according to the manufacturer's protocol. The sense primer was 5′-CACCCAAGGGAACTAGTGCAGGTTGGATGG-3′ and the antisense primer was complementary to it. For human adiponectin mutagenesis, the sense primers were 5′-CATCGGTGAAACCAGAGTACCCGGGGC-3′ for G84R, 5′-CGGGGCTGAAAGTCCCCGAGGCTTTC-3′ for G90S, 5′-GCTGAAGGTCCCTGAGGCTTTCCG GG-3′ for R92X, 5′-GGTGCCTATGTACACCGCTCAGCATTCAGT G-3′ for Y111H, 5′-GGTGCCTATGTATACTGCTCAGCATTCAGTGTGG-3′ for R112C, 5′-CCTGG GCTGTACGACTTTGCCTACCACATC-3′ for Y159D, 5′-CTACTTTGCCTACCACACCACAGTCTATATGAAGG-3′ for I164T, 5′-GTATGGGGAAGGAGAGAGTAATGGACTCTATGCTG-3′ for R221S, and 5′-GGCTTTCTTCTCTACCCTGACACCAACTGATCAC-3′ for H241P. The antisense primers were complementary to these sense primers. The coding sequence corresponding to amino acids 19-71 (from the variable region to the middle of the collagenous region) was deleted for the expression of amino-terminally truncated human adiponectin (ΔH). The sense primer was 5′-GGTCTTATTGGTCCTAAGGGAGACATCGGTG-3′ with 5′-phosphorylation, and the antisense primer was 5′-CTGGTCATGCCCGGGCAGAGCTAATAGCAG-3′ with 5′-phosphorylation. The deleted construct was amplified from human adiponectin pcDNA3.1 by pfu Taq polymerase (Stratagene), and the gained blunted DNA fragment was self-ligated to form a circular plasmid. Generation of Anti-adiponectin Antibodies—Anti-mouse adiponectin globular domain antiserum was obtained by immunizing rabbits with mouse recombinant adiponectin globular domain produced in E. coli. Anti-mouse amino-terminal peptide antibody, and anti-human carboxyl-terminal peptide antibody were raised against the synthesized mouse amino-terminal peptide EDDVTTTEELAPALV and the human carboxyl-terminal peptide CYADNDSTFTGFLLYHDTN. Anti-human carboxyl-terminal peptide antibody showed good cross-reactivity against mouse adiponectin (data not shown). Preparation of Adiponectin Globular Domain by Trypsin Digestion of Full-length Adiponectin—Full-length adiponectin expressed in NIH-3T3 fibroblasts and secreted in DMEM without serum was cleaved by trypsin V-S according to Ref. 24Fruebis J. Tsao T-S. Javorschi S. Ebbets-Reed D. Erickson M.R.S. Yen F.T. Bihain B.E. Lodish H.F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 2005-2010Crossref PubMed Scopus (1742) Google Scholar. Trypsin reportedly digests full-length adiponectin at the peptide bond between Arg-103 and Lys-104, generating the globular adiponectin (24Fruebis J. Tsao T-S. Javorschi S. Ebbets-Reed D. Erickson M.R.S. Yen F.T. Bihain B.E. Lodish H.F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 2005-2010Crossref PubMed Scopus (1742) Google Scholar). SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and Immunoblotting—SDS-PAGE was performed according to the standard Laemmli's method (25Laemmli U.K. Nature. 1970; 227: 680-685Crossref PubMed Scopus (206658) Google Scholar). Sample buffer for reducing conditions was 3% SDS, 50 mm Tris-HCl pH 6.8, 5% 2-mercaptoethanol and 10% glycerol. For complete reduction of serum sample, 10 mm dithiothreitol was also added to the buffer. For non-reducing conditions, 2-mercaptoethanol was excluded from the sample buffer described above. The sample was mixed with 5× sample buffer and incubated for 1 hour at room temperature. For heat-denaturation, samples were heated at 95 °C for 10 min unless indicated. For immunoblotting, proteins separated by SDS-PAGE were transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were blocked with TBS-T (TBS, 0.1% Triton X-100) containing 3% skim milk and then incubated with 1:1000 diluted antiserum in TBS-T containing 3% skim milk for 1 h at room temperature. After washing, the membranes were incubated with horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody (1:4000) for 30 min at room temperature and then washed thoroughly. The membranes were exposed to x-ray film (Fuji film) using ECL Western blotting detection reagent (Amersham Biosciences). Gel Filtration Chromatography Analysis of Adiponectin—Samples were filtered through 0.44-μm pore membranes and 200 μl were injected into a Superdex S300HR 10/30 (Amersham Biosciences) pre-equilibrated with PBS using the FPLC system (Amersham Biosciences) at 4 °C. Samples were eluted with PBS at a rate of 0.5 ml/min and monitored by absorbance at 280 nm. Fractions (0.5 ml) were collected. Analysis of Adiponectin from Human or Mouse Serum and Medium of 3T3-L1 Adipocytes—Freshly drawn human or mouse blood was coagulated for 30 min at room temperature. After centrifugation, 0.7 μl of the supernatant was diluted into non-reducing sample buffer and subjected to SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions. 3T3-L1 preadipocytes were differentiated into mature adipocytes for 10 days and washed twice in DMEM without serum. Adiponectin was allowed to secrete into DMEM without serum for 48 h and 10-μl aliquots were diluted into non-reducing sample buffer and subjected to SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions. For an analysis of serum of human subjects heterozygous for G90S mutation, subjects are identified through screening of 1373 French Caucasians (16Vasseur F. Helbecque N. Dina C. Lobbens S. Delannoy V. Gaget S. Boutin P Vaxillaire M. Lepretre F. Dupont S. Hara K. Clement K. Bihain B. Kadowaki T. Froguel P. Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 2607-2614Crossref PubMed Scopus (443) Google Scholar). Subjects ranging from 40 to 69 of age were selected and examined. Average age ± S.E. of these groups were 56.4 ± 7.9 (wild-type female), 54.7 ± 1.7 (G90S female), 59.4 ± 4.2 (wild-type male), 52.3 ± 2.9 (G90S male). Phosphorylation of AMPK and ACC by Adiponectin—The AMPK pathway was analyzed according to Ref. 23Yamauchi T. Kamon J. Minokoshi Y. Ito Y. Waki H. Uchida S. Yamashita S. Noda M. Kita S. Ueki K. Eto K. Akanuma Y. Froguel P. Foufelle F. Ferre P. Carling D. Kimura S. Nagai R. Kahn B.B. Kadowaki T. Nat. Med. 2002; 8: 1288-1295Crossref PubMed Scopus (3419) Google Scholar. Briefly, after cells had been incubated in serum-free RPMI 1640 medium (Sigma) for 6 h, RPMI 1640 containing E. coli recombinant adiponectin was added to the well and incubated for 5 min at 37 °C. The reaction was stopped with liquid nitrogen and cells were lysed and homogenized by a sonicator in lysis buffer (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 10 mm Na3VO4, 10 mm sodium pyrophosphate, 100 mm NaF, 10 mm EDTA, 10 mm EGTA, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 1% Nonidet P-40). The lysate was centrifuged and the protein concentration was assayed using BCA protein assay reagent (Pierce). The same amount of lysate protein was applied to SDS-PAGE under reducing and heat-denaturing conditions, blotted onto PVDF membranes and immunostained with anti-phosphorylated AMPK antibodies or anti-phosphorylated ACC antibodies. NIH-Image was used for band quantification. SDS-PAGE under Non-reducing and Non-heat-denaturing Conditions Separates Multimer Species of Adiponectin—Adiponectin was reported to form several different molecular weight multimers by gel filtration and velocity gradient studies (1Scherer P.E. Williams S. Fogliano M. Baldini G. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26746-26749Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2724) Google Scholar, 4Nakano Y. Tobe T. Choi-Miura N.H. Mazda T. Tomita M. J. Biochem. 1996; 120: 803-812Crossref PubMed Scopus (783) Google Scholar, 5Arita Y. Kihara S. Ouchi N. Takahashi M. Maeda K. Miyagawa J. Hotta K. Shimomura I. Nakamura T. Miyaoka K. Kuriyama H. Nishida M. Yamashita S. Okubo K. Matsubara K. Muraguchi M. Ohmoto Y. Funahashi T. Matsuzawa Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 79-83Crossref PubMed Scopus (4039) Google Scholar, 21Tsao T-S. Murrey H.E. Hug C. Lee D.H. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 2002; 277: 29359-29362Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (334) Google Scholar). When human and mouse adiponectin from serum or adipocytes, and recombinant adiponectin expressed in mammalian cells, were separated by SDS-PAGE under non-reducing and non-heat-denaturing conditions, three different molecular mass species (∼67, 136, and >300 kDa) of adiponectin were detected in all preparations (Fig. 1A). We designated these species as LMW (low molecular weight), MMW (middle molecular weight), and HMW (high molecular weight) multimers, respectively. In order to demonstrate these three species seen in Fig. 1A represent different multimer species, we subjected adiponectin to gel filtration analysis in parallel. Purified mouse adiponectin expressed in NIH-3T3 resolved into three peaks in gel filtration as reported before (Fig. 1B) (21Tsao T-S. Murrey H.E. Hug C. Lee D.H. Lodish H.F. J. Biol. Chem. 2002; 277: 29359-29362Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (334) Google Scholar). SDS-PAGE analysis of each fraction revealed that these three peaks represented HMW, MMW, and LMW multimers (Fig. 1C). Adiponectin in human serum and adiponectin expressed in E. coli also had three peaks, which corresponded to HMW, MMW and LMW multimers (Fig. 1D). Fig. 1, E and F are examples showing adiponectin multimer distribution in serum of representative female and male human subjects. Both non-reducing and non-heat-denaturing SDS-PAGE (Fig. 1E) and gel filtration analysis (Fig. 1F) clearly demonstrated that the levels of HMW multimers were high in a female subject and low in a male subject. These data suggested that non-reducing and non-heat-denaturing SDS-PAGE was able to represent different adiponectin multimers as accurately as the conventional gel filtration analysis. Our SDS-PAGE analysis was superior to the gel filtration analysis in terms of resolving power. SDS-PAGE was able to clearly separate each of multimer species (Fig. 1E), whereas gel filtration did not completely separate each multimers (Fig. 1F). We also noted that there were several HMW species, whereas murine adiponectin had only one (Fig. 1A). These species were not recognized by conventional gel filtration analysis (Fig. 1F). Total adiponectin concentrations are known to be higher in females than in males (5Arita Y. Kihara S. Ouchi N. Takahashi M. Maeda K. Miyagawa J. Hotta K. Shimomura I. Nakamura T. Miyaoka K. Kuriyama H. Nishida M. Yamashita S. Okubo K. Matsubara K. Muraguchi M. Ohmoto Y. Funahashi T. Matsuzawa Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 79-83Crossref PubMed Scopus (4039) Google Scholar). HMW multimers, but not MMW and LMW multimers, were significantly less abundant in male subjects than in female subjects (Fig. 1, E and F and Table I). This suggested that not only total adiponectin concentration but also multimer distribution are different in two genders.Table IGender difference in the multimer formation of adiponectinFemaleMaleHMW100 ± 1929.0 ± 14ap < 0.05 (Student's t-test) values of the same multimer species were compared between genders.MMW100 ± 6.981.5 ± 5.2LMW100 ± 1284.0 ± 6.6a p < 0.05 (Student's t-test) values of the same multimer species were compared between genders. Open table in a new tab Influence of Reduction and Heat Denaturation on Adiponectin Multimer Formation—When adiponectin expressed in NIH-3T3 or serum adiponectin were electrophoresed after reduction and heat denaturation, all molecular mass species were converted to a single 28-kDa band, indicating all of these species to be composed of identical monomers, namely, homomultimers (Fig. 2, A and B, lane 4). 56- and 28-kDa bands were seen, when the sample was heat-denatured under non-reducing conditions, suggesting the 56-kDa band to be a dimer (Fig. 2, A and B, lane 2). On the other hand, reduction without heat denaturation converted all of the molecular mass species to a 67-kDa band, which was the smallest molecular weight component of adiponectin, that is, a LMW multimer (Fig. 2, A and B, lane 3). This 67-kDa band was deduced to represent a trimer because the collagen-like structure and the globular domain of adiponectin are known to form a trimer (17Shapiro L. Scherer P.E. Curr. Biol. 1998; 8: 335-338Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). To prove the 67-kDa band to be a trimer, we co-expressed amino-terminally truncated adiponectin (ΔH) and full-length wild-type adiponectin (WT). Two heterogeneous bands were observed when samples were separated by reducing and non-heat-denaturing SDS-PAGE (Fig. 3A, lane 4). These data suggested that the 67-kDa band (Fig. 3A, lane 2, Fig. 2, A and B, lane 3) was a trimer, and the two heterogeneous bands (Fig. 3A, lane 4) were heterotrimers (i.e. WT x2/ΔH x1, WT x1/ΔH x2). The size of 67 kDa, w

The adipocyte-derived hormone adiponectin has been shown to play important roles in the regulation of energy homeostasis and insulin sensitivity. In this study, we analyzed globular domain adiponectin (gAd) transgenic (Tg) mice crossed with leptin-deficient ob/ob or apoE-deficient mice. Interestingly, despite an unexpected similar body weight, gAd Tg ob/ob mice showed amelioration of insulin resistance and β-cell degranulation as well as diabetes, indicating that globular adiponectin and leptin appeared to have both distinct and overlapping functions. Amelioration of diabetes and insulin resistance was associated with increased expression of molecules involved in fatty acid oxidation such as acyl-CoA oxidase, and molecules involved in energy dissipation such as uncoupling proteins 2 and 3 and increased fatty acid oxidation in skeletal muscle of gAd Tg ob/ob mice. Moreover, despite similar plasma glucose and lipid levels on an apoE-deficient background, gAd Tg apoE-deficient mice showed amelioration of atherosclerosis, which was associated with decreased expression of class A scavenger receptor and tumor necrosis factor α. This is the first demonstration that globular adiponectin can protect against atherosclerosis in vivo. In conclusion, replenishment of globular adiponectin may provide a novel treatment modality for both type 2 diabetes and atherosclerosis.

Adipose tissue expression and circulating concentrations of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) correlate positively with adiposity. To ascertain the roles of MCP-1 overexpression in adipose, we generated transgenic mice by utilizing the adipocyte P2 (aP2) promoter (aP2-MCP-1 mice). These mice had higher plasma MCP-1 concentrations and increased macrophage accumulation in adipose tissues, as confirmed by immunochemical, flow cytometric, and gene expression analyses. Tumor necrosis factor-α and interleukin-6 mRNA levels in white adipose tissue and plasma non-esterified fatty acid levels were increased in transgenic mice. aP2-MCP-1 mice showed insulin resistance, suggesting that inflammatory changes in adipose tissues may be involved in the development of insulin resistance. Insulin resistance in aP2-MCP-1 mice was confirmed by hyperinsulinemic euglycemic clamp studies showing that transgenic mice had lower rates of glucose disappearance and higher endogenous glucose production than wild-type mice. Consistent with this, insulin-induced phosphorylations of Akt were significantly decreased in both skeletal muscles and livers of aP2-MCP-1 mice. MCP-1 pretreatment of isolated skeletal muscle blunted insulin-stimulated glucose uptake, which was partially restored by treatment with the MEK inhibitor U0126, suggesting that circulating MCP-1 may contribute to insulin resistance in aP2-MCP-1 mice. We concluded that both paracrine and endocrine effects of MCP-1 may contribute to the development of insulin resistance in aP2-MCP-1 mice. Adipose tissue expression and circulating concentrations of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) correlate positively with adiposity. To ascertain the roles of MCP-1 overexpression in adipose, we generated transgenic mice by utilizing the adipocyte P2 (aP2) promoter (aP2-MCP-1 mice). These mice had higher plasma MCP-1 concentrations and increased macrophage accumulation in adipose tissues, as confirmed by immunochemical, flow cytometric, and gene expression analyses. Tumor necrosis factor-α and interleukin-6 mRNA levels in white adipose tissue and plasma non-esterified fatty acid levels were increased in transgenic mice. aP2-MCP-1 mice showed insulin resistance, suggesting that inflammatory changes in adipose tissues may be involved in the development of insulin resistance. Insulin resistance in aP2-MCP-1 mice was confirmed by hyperinsulinemic euglycemic clamp studies showing that transgenic mice had lower rates of glucose disappearance and higher endogenous glucose production than wild-type mice. Consistent with this, insulin-induced phosphorylations of Akt were significantly decreased in both skeletal muscles and livers of aP2-MCP-1 mice. MCP-1 pretreatment of isolated skeletal muscle blunted insulin-stimulated glucose uptake, which was partially restored by treatment with the MEK inhibitor U0126, suggesting that circulating MCP-1 may contribute to insulin resistance in aP2-MCP-1 mice. We concluded that both paracrine and endocrine effects of MCP-1 may contribute to the development of insulin resistance in aP2-MCP-1 mice. Obesity correlates closely with insulin resistance (1Flier J.S. Cell. 2004; 116: 337-350Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (962) Google Scholar, 2Wellen K.E. Hotamisligil G.S. J. Clin. Investig. 2005; 115: 1111-1119Crossref PubMed Scopus (3225) Google Scholar). We have demonstrated that the size of adipocytes is inversely related to insulin sensitivity (3Okuno A. Tamemoto H. Tobe K. Ueki K. Mori Y. Iwamoto K. Umesono K. Akanuma Y. Fujiwara T. Horikoshi H. Yazaki Y. Kadowaki T. J. Clin. Investig. 1998; 101: 1354-1361Crossref PubMed Scopus (927) Google Scholar, 4Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Nagai R. Tobe K. Kimura S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1225) Google Scholar, 5Kadowaki T. J. Clin. Investig. 2000; 106: 459-465Crossref PubMed Scopus (220) Google Scholar); namely, larger adipocytes are associated with insulin resistance, smaller adipocytes, with insulin sensitivity. Energy excess results in adipocyte hypertrophy, which in turn exerts deleterious effects on insulin sensitivity. Larger adipocytes are less insulin-sensitive as shown by impaired insulin stimulated glucose uptake. Moreover, diet-induced hypertrophy of adipocytes leads to changes in the profile of adipokines toward a deterioration of insulin sensitivity, particularly with decreased adiponectin levels (6Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4099) Google Scholar, 7Berg A.H. Combs T.P. Du X. Brownlee M. Scherer P.E. Nat. Med. 2001; 7: 947-953Crossref PubMed Scopus (2218) Google Scholar). Recent studies have shown that obesity is associated not only with larger adipocytes but also with increasing numbers of infiltrating macrophages in adipose tissues (8Soukas A. Cohen P. Socci N.D. Friedman J.M. Genes Dev. 2000; 14: 963-980PubMed Google Scholar, 9Weisberg S.P. McCann D. Desai M. Rosenbaum M. Leibel R.L. Ferrante Jr., A.W. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1796-1808Crossref PubMed Scopus (7562) Google Scholar, 10Xu H. Barnes G.T. Yang Q. Tan G. Yang D. Chou C.J. Sole J. Nichols A. Ross J.S. Tartaglia L.A. Chen H. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1821-1830Crossref PubMed Scopus (5240) Google Scholar). These adipose tissue macrophages are currently considered to be a major cause of obesity-associated chronic low grade inflammation (2Wellen K.E. Hotamisligil G.S. J. Clin. Investig. 2005; 115: 1111-1119Crossref PubMed Scopus (3225) Google Scholar, 11Wellen K.E. Hotamisligil G.S. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1785-1788Crossref PubMed Scopus (1452) Google Scholar) via secretion of a wide variety of inflammatory molecules (12Kershaw E.E. Flier J.S. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004; 89: 2548-2556Crossref PubMed Scopus (3754) Google Scholar), including tumor necrosis factor-α (TNF-α) 2The abbreviations used are: TNF-α, tumor necrosis factor-α; IL-6, interleukin-6; MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1; WAT, white adipose tissue; CCR2, C-C motif chemokine receptor 2; TG, transgenic; aP2, adipocyte P2; WT, wild type; ITT, insulin tolerance test; NEFA, non-esterified fatty acid; IR, insulin receptor; IRS, IR substrate; ERK, extracellular signal-regulated kinase; MEK, mitogen-activated extracellular signal protein kinase; BAT, brown adipose tissue; MMP12, matrix metallopeptidase 12; PPARγ, peroxisome proliferator-activated receptor γ; SVC, stromal-vascular cell; 2-DG, 2-deoxyglucose; Rd, rate of glucose disappearance; EGP, endogenous glucose production; ANOVA, analysis of variance; eWAT, epididymal WAT; HF, high fat; NC, normal chow. (13Hotamisligil G.S. Shargill N.S. Spiegelman B.M. Science. 1993; 259: 87-91Crossref PubMed Scopus (6193) Google Scholar), interleukin-6 (IL-6) (14Fernandez-Real J.M. Ricart W. Endocr. Rev. 2003; 24: 278-301Crossref PubMed Scopus (727) Google Scholar), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) (15Takahashi K. Mizuarai S. Araki H. Mashiko S. Ishihara A. Kanatani A. Itadani H. Kotani H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 46654-46660Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (268) Google Scholar, 16Christiansen T. Richelsen B. Bruun J.M. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2005; 29: 146-150Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar), and plasminogen activator inhibitor-1 (17Shimomura I. Funahashi T. Takahashi M. Maeda K. Kotani K. Nakamura T. Yamashita S. Miura M. Fukuda Y. Takemura K. Tokunaga K. Matsuzawa Y. Nat. Med. 1996; 2: 800-803Crossref PubMed Scopus (823) Google Scholar). These inflammatory molecules may have local effects on white adipose tissue (WAT) physiology as well as potential systemic effects on other organs, which culminate in insulin resistance (12Kershaw E.E. Flier J.S. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004; 89: 2548-2556Crossref PubMed Scopus (3754) Google Scholar). The molecular signals that trigger the macrophage accumulation in obese WAT are, however, not yet known. How macrophage accumulation in adipose tissues causes systemic insulin resistance is currently unknown. Among inflammatory molecules up-regulated in adipose tissues of obese animals and humans, MCP-1 has been viewed as one of the likely candidate adipokines initiating macrophage infiltration of the adipose tissue and inducing systemic insulin resistance. MCP-1 is a member of the CC chemokine family and promotes migration of inflammatory cells by chemotaxis and integrin activation (18Ashida N. Arai H. Yamasaki M. Kita T. J. Biol. Chem. 2001; 276: 16555-16560Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (174) Google Scholar), and it has been reported to recruit monocytes from the blood into atherosclerotic lesions, thereby promoting foam cell formation (19Boring L. Gosling J. Cleary M. Charo I.F. Nature. 1998; 394: 894-897Crossref PubMed Scopus (1686) Google Scholar, 20Gu L. Okada Y. Clinton S.K. Gerard C. Sukhova G.K. Libby P. Rollins B.J. Mol. Cell. 1998; 2: 275-281Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1380) Google Scholar, 21Linton M.F. Fazio S. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2003; 27: 35-40Crossref PubMed Scopus (233) Google Scholar). MCP-1 expression in adipose tissue and plasma MCP-1 levels have been found to correlate positively with the degree of obesity (9Weisberg S.P. McCann D. Desai M. Rosenbaum M. Leibel R.L. Ferrante Jr., A.W. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1796-1808Crossref PubMed Scopus (7562) Google Scholar, 10Xu H. Barnes G.T. Yang Q. Tan G. Yang D. Chou C.J. Sole J. Nichols A. Ross J.S. Tartaglia L.A. Chen H. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1821-1830Crossref PubMed Scopus (5240) Google Scholar, 16Christiansen T. Richelsen B. Bruun J.M. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2005; 29: 146-150Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 22Sartipy P. Loskutoff D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 7265-7270Crossref PubMed Scopus (919) Google Scholar). In addition, increased expression of this chemokine in adipose tissue precedes the expression of other macrophage markers during the development of obesity (10Xu H. Barnes G.T. Yang Q. Tan G. Yang D. Chou C.J. Sole J. Nichols A. Ross J.S. Tartaglia L.A. Chen H. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1821-1830Crossref PubMed Scopus (5240) Google Scholar). A recent report on mice lacking C-C motif chemokine receptor-2 (CCR2), a receptor for MCP-1, and other several chemokines suggested the MCP-1/CCR2 pathway to influence the development of obesity and insulin resistance via adipose macrophage accumulation and inflammation (23Weisberg S.P. Hunter D. Huber R. Lemieux J. Slaymaker S. Vaddi K. Charo I. Leibel R.L. Ferrante A.W. J. Clin. Investig. 2006; 116: 115-124Crossref PubMed Scopus (1271) Google Scholar). Thus, we hypothesized that MCP-1 may serve as a signal that triggers inflammation by attracting macrophages into adipose tissues as well as an adipokine that causes insulin resistance by directly affecting insulin signaling in other organs. In this study, we assessed the effect of adipose overexpression of MCP-1 on the development of insulin resistance by generating transgenic (TG) mice under the adipocyte P2 (aP2) promoter. The TG mice showed increased macrophage accumulation in adipose tissues with higher plasma MCP-1 concentrations than littermate wild-type (WT) mice. The TG mice were insulin-resistant as shown by insulin tolerance test (ITT), hyperinsulinemic euglycemic studies, and insulin signal studies. Because the TG mice displayed increased gene expression of TNF-α and IL-6 as well as higher plasma concentrations of non-esterified fatty acids (NEFAs), adipocyte dysfunction caused by macrophage accumulation in adipose tissue may contribute to the development of systemic insulin resistance. In addition, we demonstrated that MCP-1 directly attenuated insulin signaling in myotube cells and insulin-stimulated glucose uptake in isolated skeletal muscle, suggesting that higher circulating MCP-1 may have a direct negative impact on insulin-stimulated glucose uptake in aP2-MCP-1 mice. Thus, we conclude that both macrophage accumulation leading to adipocyte dysfunction (local effects on adipose tissues) and direct effects of circulating MCP-1 on insulin target organs (endocrine effects) contribute to the development of insulin resistance in aP2-MCP-1 mice. Reagents—Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein was purchased from R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN). U0126 was purchased from Calbiochem. 2-Deoxy-d-[1-14C]glucose and l-[1-3H]glucose were purchased from American Radiolabeled Chemicals Inc. (St. Louis, MO). Mouse monoclonal anti-phosphotyrosine antibody 4G10 (αPY), rabbit polyclonal antibodies to insulin receptor substrate (IRS)-1, IRS-2, and the phosphatidylinositol 3-kinase p85 regulatory subunit were purchased from Upstate Biotechnology Inc. Rabbit polyclonal antibody to insulin receptor β (IRβ) was purchased from Santa Cruz Biotechnology. Rabbit polyclonal antibodies against p44/42 MAPK, phosphor-p44/42 MAPK, Akt, and phospho-Akt (Ser-473) were purchased from Cell Signaling Technology. Cell Culture, Differentiation, and in Vitro Assay—C2C12 mouse skeletal myoblast cell lines were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin in humidified 5% CO2, 95% air at 37 °C and cultured to confluence. To induce differentiation, cells were switched to media containing Dulbecco's modified Eagle's medium, 2.5% horse serum, 100 units/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin for the indicated time periods. For the Western blotting analyses, cells were serum-deprived for 10 h in media and treated with 10 nm MCP-1 for 5 min to detect the extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation. C2C12 cells were treated with 1-10 nm MCP-1 for 30 min before 10 nm insulin stimulation to test activation of insulin signaling. In some experiments cells were pretreated with U0126, an inhibitor of mitogen-activated extracellular signal protein kinase (MEK), for 30 min before MCP-1 addition. Generation of TG Mice Expressing MCP-1 in Adipose Tissues—A murine MCP-1 coding sequence cDNA for insertion was prepared by cloning reverse transcriptase-PCR products from mouse macrophage mRNA into a 2.1-TOPO cloning vector (Invitrogen). For overexpression in adipose tissues, transgene expression was targeted to adipose tissue using the mouse aP2 promoter (24Graves R.A. Tontonoz P. Platt K.A. Ross S.R. Spiegelman B.M. J. Cell. Biochem. 1992; 49: 219-224Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar) kindly provided by Dr. Bruce Spiegelman (Dana Farber Institute, Boston, MA). The transgene consisted of 5.4 kilobases of the aP2 gene promoter linked to rabbit β-globin, the 447 bp MCP-1 cDNA, and a polyadenylation sequence (Fig. 2A). The construct was inserted into a pUC19 vector (Nippon Gene Co., Ltd.) and cloned. The purified AscI-AscI fragment was microinjected into the pronuclei of fertilized DBF2 eggs. The recipient eggs were [C57BL/6 × DBA2] F2 hybrids. TG founder or F2 mice were identified by Southern blot analysis of tail DNAs using the cDNA probe to the BamHI/BamHI site in MCP-1 and PCR. The primers used for genotyping PCR were as follows: 5′ primer, 5′-CATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTAC-3′, and 3′ primer, 5′-CTAGTTCACTGTCACACTGGTC-3′. From the 13 lines of TG mice obtained, we selected three lines showing graded expression of MCP-1 and designated them low (L), middle (M), and high (H). The founder and TG descendants were bred onto a C57BL/6 background for two generations. The F2 TG mice and their littermates were used in experiments. TG mice served as heterozygotes. Animal Care—ob/ob mice with a C57BL/6 background were purchased from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). C57BL/6 mice were purchased from CLEA Japan (Tokyo, Japan). Mice were housed under a 12-h light-dark cycle and given ad libitum access to normal chow MF consisting of 25% (w/w) protein, 53% carbohydrates, 6% fat, and 8% water (Oriental Yeast Co., Ltd., Osaka, Japan) or a high fat diet 32 consisting of 25.5% (w/w) protein, 2.9% fiber, 4.0% ash, 29.4% carbohydrates, 32% fat, and 6.2% water (CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan). All experiments in this study were performed on male mice. The animal care and procedures for the experiments were approved by the Animal Care Committee of the University of Tokyo. RNA Preparation and Northern Blot Analysis—Mice were sacrificed after a 6-h fast and the epididymal fat pad (for epididymal WAT), subcutaneous fat (for subcutaneous WAT), brown adipose tissue (BAT), liver, spleen, kidney, heart, and muscle were excised. Total RNA was prepared from tissues using TRIzol Reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Northern blot analysis was performed with 15 μg of total RNA according to the standard protocol. Total RNA was loaded onto a 1.3% agarose gel then transferred to a nylon membrane (Hybond N+; Amersham Biosciences). MCP-1 coding sequence cDNA was used as the probe template. The corresponding bands were quantified by exposure of BAS 2000 to the filters and measurement with BAStation software (Fuji Film, Tokyo, Japan). Quantitative Reverse Transcriptase-PCR—Total RNA was extracted from various tissues or C2C12 cells with TRIzol reagent according to the manufacturer's instructions. After treatment with RQ1 RNase-free DNase (Promega, Madison, WI) to remove genomic DNA, cDNA was synthesized with MultiScribe reverse transcriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA), and TaqMan quantitative PCR (50 °C for 2 min, 95 °C for 10 min followed by 40 cycles of 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min) was then performed with the ABI Prism 7900 PCR instrument (Applied Biosystems) to amplify samples for MCP-1, F4/80, CD68, matrix metallopeptidase 12 (MMP12), glucose-6-phosphatase, TNF-α, IL-6, resistin, adiponectin, leptin, peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), CCR2, and cyclophilin cDNA. The primers used for cyclophilin were as described previously (25Suzuki R. Tobe K. Terauchi Y. Komeda K. Kubota N. Eto K. Yamauchi T. Azuma K. Kaneto H. Taguchi T. Koga T. German M.S. Watada H. Kawamori R. Wright C.V. Kajimoto Y. Kimura S. Nagai R. Kadowaki T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 43691-43698Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (30) Google Scholar), and those for the other reactions were purchased from Applied Biosystems. The relative abundance of transcripts was normalized to constitutive expression of cyclophilin mRNA. Isolation of Adipocytes and Stromal-vascular Cells (26Takahashi M. Kamei Y. Ezaki O. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2005; 288: 117-124Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar)—Mice were anesthetized, and epididymal white fat pads were removed. The fat pads were rinsed in saline and cut into small pieces, then digested with collagenase (Sigma-Aldrich) with Krebs-Henseleit-HEPES buffer, pH 7.4, supplemented with 20 mg/ml of bovine serum albumin and 2 mmol/liter glucose at 37 °C in a shaking water bath for 45 min. Then digested tissues were filtered through mesh and fractionated by brief centrifugation (1000 rpm). Floating cells were adipocytes, and the pellet was nonadipocytes (stromal-vascular cells (SVCs)). Both cell types were rinsed three times with Krebs-Henseleit-HEPES buffer and used in RNA extraction or flow cytometry analysis. Flow Cytometry Analysis (9Weisberg S.P. McCann D. Desai M. Rosenbaum M. Leibel R.L. Ferrante Jr., A.W. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1796-1808Crossref PubMed Scopus (7562) Google Scholar, 23Weisberg S.P. Hunter D. Huber R. Lemieux J. Slaymaker S. Vaddi K. Charo I. Leibel R.L. Ferrante A.W. J. Clin. Investig. 2006; 116: 115-124Crossref PubMed Scopus (1271) Google Scholar)—In the SVCs red blood cells were lysed and removed by a 15-min incubation in Pharm Lyse (BD Biosciences) at 4 °C. The SVCs were rinsed twice and resuspended in Pharmingen stain buffer (BD Biosciences). The cell number was calculated by hemocytometing, and the cells were incubated with FcBlock (BD Biosciences) for 10 min at 4 °C before the incubation with either anti-mouse CD11b antibodies conjugated with Alexa Fluor488 (Caltag Laboratories) or anti-mouse F4/80 antibodies conjugated with phycoerythrin (Caltag Laboratories) or each of the matching isotopes as controls for 30 min at 4 °C. After incubation with the antibodies, the cells were rinsed twice and resuspended in Pharmingen stain buffer. After labeling with TO-PRO-3 (Invitrogen), the cells were analyzed by FACSCalibur (BD Biosciences). Data acquisition and analysis were performed using CellQuest Pro software (BD Biosciences). Dead cells were gated out by a combination of forward scatter side scatter (FSC/SSC) and TO-PRO-3 dot plots. The numbers of macrophages in epididymal white adipose tissues were calculated by multiplying the number of SVCs by the percentage of CD11d and F4/80 double positive cells. Immunoprecipitation and Western Blot Analysis—Tissues and cells were homogenized and lysed with ice-cold buffer A (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 10 mm sodium orthovanadate, 10 mm sodium pyrophosphate, 100 mm sodium fluoride, 10 mm EDTA, 10 mm EGTA, and 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride). After centrifugation, immunoprecipitation of liver and muscle proteins was performed as described previously (27Yamauchi T. Tobe K. Tamemoto H. Ueki K. Kaburagi Y. Yamamoto-Honda R. Takahashi Y. Yoshizawa F. Aizawa S. Akanuma Y. Sonenberg N. Yazaki Y. Kadowaki T. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 3074-3084Crossref PubMed Scopus (250) Google Scholar) with some modifications. Samples were separated on polyacrylamide gels and transferred to Hybond-P PVDF transfer membrane (Amersham Biosciences). After incubating the membrane with antibodies, bands were detected by ECL detection reagents (Amersham Biosciences). Histological and Immunohistochemical Analysis of WAT—An epididymal fat pad was removed from each animal, fixed in 10% formaldehyde/phosphate-buffered saline, and maintained at 4 °C for 2 days. Fixed specimens were dehydrated and embedded in paraffin. The fat pad was then cut into 5-μm sections at 50-μm intervals and then mounted on silanized slides. After deparaffinization, the sections were stained with rat monoclonal F4/80 antibody (Serotec Ltd.) at a 1:1000 concentration followed by counter-staining with hematoxylin. The adipocyte area was manually traced and analyzed with Win ROOF software (Mitani Co. Ltd., Chiba, Japan). The area was measured in four high-power fields (275,000 μm2/field) from different sections, and the histogram was drawn by analyzing 6 mice per group according to methods described previously (4Kubota N. Terauchi Y. Miki H. Tamemoto H. Yamauchi T. Komeda K. Satoh S. Nakano R. Ishii C. Sugiyama T. Eto K. Tsubamoto Y. Okuno A. Murakami K. Sekihara H. Hasegawa G. Naito M. Toyoshima Y. Tanaka S. Shiota K. Kitamura T. Fujita T. Ezaki O. Aizawa S. Nagai R. Tobe K. Kimura S. Kadowaki T. Mol. Cell. 1999; 4: 597-609Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1225) Google Scholar) with modifications. The adipocyte area was measured in 400 or more cells per mouse on normal chow or in 180 or more cells per mouse on the high fat diet. The total number of nuclei and the number of F4/80 positive nuclei were counted in four different high-power fields from each of four different sections. The nuclei of more than 2000 cells per mouse on normal chow or more than 1000 cells per mouse on the high fat diet were counted. The ratio of F4/80 positive nuclei was calculated as the number of nuclei of F4/80-expressing cells divided by the total number of nuclei in sections of a sample. Measurement of 2-Deoxyglucose (2-DG) Uptake—This assay was performed as described previously (28Murakami K. Tsunoda M. Ide T. Ohashi M. Mochizuki T. Metabolism. 1999; 48: 1450-1454Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (15) Google Scholar) with some modifications. The soleus muscles of 9-week-old C57BL/6 mice were removed from the hindlimbs, ligated around each tendon using silk surgical thread, and attached across a plastic holder. The muscles were incubated for 10 min at 37 °C in Krebs-Ringer phosphate buffer, pH 7.4, containing 5 mm HEPES, 3% bovine serum albumin, and 2 mm sodium pyruvate (buffer A). For MCP-1 pretreatment, the muscles were incubated in buffer A containing 0, 0.1, 1, or 10 nm MCP-1 for 30 min at 37 °C before insulin treatment. The muscles were incubated with or without 10 nm insulin in buffer A containing 0, 0.1, 1, or 10 nm MCP-1 at 30 °C for 10 min. To determine 2-DG uptake, the muscles were transferred to buffer A containing 1 mm 2-DG (0.5 μCi/ml 2-deoxy-d-[1-14C]glucose) and 1 mm l-glucose (0.5 μCi/ml l-[1-3H]glucose) and incubated at 30 °C for 10 min. For U0126 rescue experiments, 20 μm U0126 were added to all of the buffers. The buffers were continuously gassed with 95% O2, 5%CO2 in a shaking incubator. To terminate the reaction, the muscles were washed 3 times with chilled buffer A and then dissolved in 5 n NaOH. The samples were neutralized with 5 n HCl and dissolved in ACSII (Amersham Biosciences). 14C and 3H specific activities were counted by a liquid scintillation counter (Packard Instrument Co.). The specific uptake of 2-DG was calculated by subtracting the nonspecific uptake of l-glucose from total uptake 2-DG uptake. Plasma MCP-1, Adiponectin, Leptin, and NEFA Measures—Mice were fasted for 6 h before plasma was obtained. Plasma MCP-1, adiponectin, and leptin levels were determined with a mouse JE/MCP-1 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems), mouse adiponectin ELISA kit (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd, Tokyo, Japan), and mouse leptin ELISA kit (R&D Systems), respectively. Plasma NEFAs (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) were assayed by enzymatic methods. Measurement of Tissue Triglyceride Contents—Liver and muscle tissues were homogenized, and their triglyceride contents were determined as described previously (6Yamauchi T. Kamon J. Waki H. Terauchi Y. Kubota N. Hara K. Mori Y. Ide T. Murakami K. Tsuboyama-Kasaoka N. Ezaki O. Akanuma Y. Gavrilova O. Vinson C. Reitman M.L. Kagechika H. Shudo K. Yoda M. Nakano Y. Tobe K. Nagai R. Kimura S. Tomita M. Froguel P. Kadowaki T. Nat. Med. 2001; 7: 941-946Crossref PubMed Scopus (4099) Google Scholar). ITT—Insulin tolerance was tested in mice fasted for 4 h. The animals were intraperitoneally injected with 0.75 milliunits/g (body weight) human insulin (Humulin R; Lilly). Blood samples were drawn from the tail vein at the times indicated, and glucose was measured with an automatic blood glucose meter (Glutest Pro, Sanwa Chemical, Nagoya, Japan). Glucose Tolerance Test—Before the study the mice were fasted for 16 h starting at 19:00, and at the end of the fast they were orally loaded with glucose at 1.0 mg/g (body weight). Blood samples were collected at different times, and glucose was immediately measured with an automatic blood glucose meter. Whole blood was collected and centrifuged in heparinized tubes, and the plasma was stored at -20 °C. Insulin levels were determined with an insulin radioimmunoassay kit (BIOTRAK, Amersham Biosciences) using rat insulin as the standard. Tissue Sampling for Insulin Signaling Pathway Study—Mice were anesthetized after 24 h of starvation, and 5 units of human insulin (Humulin R, Lilly) were injected into the inferior vena cava. After 5 min, the liver and hindlimb muscles were removed, and the samples were then used for protein extraction as described above. Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp Study—Clamp studies were carried out as described previously (29Suzuki R. Tobe K. Aoyama M. Inoue A. Sakamoto K. Yamauchi T. Kamon J. Kubota N. Terauchi Y. Yoshimatsu H. Matsuhisa M. Nagasaka S. Ogata H. Tokuyama K. Nagai R. Kadowaki T. J. Biol. Chem. 2004; 279: 25039-25049Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (59) Google Scholar). In brief, 4-5 days before the study, an infusion catheter was inserted into the right jugular vein under general anesthesia with sodium pentobarbital. Studies were performed on mice under conscious and unstressed conditions after a 6-h fast. A primed-continuous infusion of insulin (Humulin R; Lilly) was given (3.0 milliunits/kg/min for normal chow (NC) fed mice and 10.0 milliunits/kg/min for high fat (HF) diet-fed mice), and the blood glucose concentration, monitored every 5 min, was maintained at ∼120 mg/dl by administration of glucose (5 g of glucose/10 ml enriched to ∼20% with [6,6-2H2]glucose (Sigma)) for 120 min. Blood was sampled via tail-tip bleeds at 90, 105, and 120 min for determination of the rate of glucose disappearance (Rd). Rd was calculated according to non-steady-state equations (29Suzuki R. Tobe K. Aoyama M. Inoue A. Sakamoto K. Yamauchi T. Kamon J. Kubota N. Terauchi Y. Yoshimatsu H. Matsuhisa M. Nagasaka S. Ogata H. Tokuyama K. Nagai R. Kadowaki T. J. Biol. Chem. 2004; 279: 25039-25049Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (59) Google Scholar), and endogenous glucose production (EGP) was calculated as the difference between Rd and exogenous glucose infusion rates (29Suzuki R. Tobe K. Aoyama M. Inoue A. Sakamoto K. Yamauchi T. Kamon J. Kubota N. Terauchi Y. Yoshimatsu H. Matsuhisa M. Nagasaka S. Ogata H. Tokuyama K. Nagai R. Kadowaki T. J. Biol. Chem. 2004; 279: 25039-25049Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (59) Google Scholar). Statistical Analysis—Results were expressed as the means ± S.E. Differences between groups were examined for statistical significance using Student's t test, analysis of variance (ANOVA) with Fisher's protected least significant difference test, or ANOVA with the