Biofilm formation and surface attachment in multiple Alphaproteobacteria is driven by unipolar polysaccharide (UPP) adhesins. The pathogen Agrobacterium tumefaciens produces a UPP adhesin, which is regulated by the intracellular second messenger cyclic diguanylate monophosphate (c-di-GMP). Prior studies revealed that DcpA, a diguanylate cyclase-phosphodiesterase, is crucial in control of UPP production and surface attachment. DcpA is regulated by PruR, a protein with distant similarity to enzymatic domains known to coordinate the molybdopterin cofactor (MoCo). Pterins are bicyclic nitrogen-rich compounds, several of which are produced via a nonessential branch of the folate biosynthesis pathway, distinct from MoCo. The pterin-binding protein PruR controls DcpA activity, fostering c-di-GMP breakdown and dampening its synthesis. Pterins are excreted, and we report here that PruR associates with these metabolites in the periplasm, promoting interaction with the DcpA periplasmic domain. The pteridine reductase PruA, which reduces specific dihydro-pterin molecules to their tetrahydro forms, imparts control over DcpA activity through PruR. Tetrahydromonapterin preferentially associates with PruR relative to other related pterins, and the PruR-DcpA interaction is decreased in a pruA mutant. PruR and DcpA are encoded in an operon with wide conservation among diverse Proteobacteria including mammalian pathogens. Crystal structures reveal that PruR and several orthologs adopt a conserved fold, with a pterin-specific binding cleft that coordinates the bicyclic pterin ring. These findings define a pterin-responsive regulatory mechanism that controls biofilm formation and related c-di-GMP-dependent phenotypes in A. tumefaciens and potentially acts more widely in multiple proteobacterial lineages.

Methyl-coenzyme M reductase (MCR) is a central player in methane biogeochemistry, governing methanogenesis and the anaerobic oxidation of methane (AOM) in methanogens and anaerobic methanotrophs (ANME), respectively. The prosthetic group of MCR is coenzyme F430, a nickel-containing tetrahydrocorphin. Several modified versions of F430 have been discovered, including the 172-methylthio-F430 (mtF430) used by ANME-1 MCR. Here, we employ molecular dynamics (MD) simulations to investigate the active site dynamics of MCR from Methanosarcina acetivorans and ANME-1 when bound to the canonical F430 compared to 172-thioether coenzyme F430 variants and substrates (methyl-coenzyme M and coenzyme B) for methane formation. Our simulations highlight the importance of the Gln to Val substitution in accommodating the 172 methylthio modification in ANME-1 MCR. Modifications at the 172 position disrupt the canonical substrate positioning in M. acetivorans MCR. However, in some replicates, active site reorganization to maintain substrate positioning suggests that the modified F430 variants could be accommodated in a methanogenic MCR. We additionally report the first quantitative estimate of MCR intrinsic electric fields that are pivotal in driving methane formation. Our results suggest that the electric field aligned along the CH3-S-CoM thioether bond facilitates homolytic bond cleavage, coinciding with the proposed catalytic mechanism. Structural perturbations, however, weaken and misalign these electric fields, emphasizing the importance of the active site structure in maintaining their integrity. In conclusion, our results deepen the understanding of MCR active site dynamics, the enzyme's organizational role in intrinsic electric fields for catalysis, and the interplay between active site structure and electrostatics.

Biofilm formation and surface attachment in multiple Alphaproteobacteria is driven by unipolar polysaccharide (UPP) adhesins. The pathogen Agrobacterium tumefaciens produces a UPP adhesin, which is regulated by the intracellular second messenger cyclic diguanylate monophosphate (cdGMP). Prior studies revealed that DcpA, a diguanylate cyclase-phosphodiesterase (DGC-PDE), is crucial in control of UPP production and surface attachment. DcpA is regulated by PruR, a protein with distant similarity to enzymatic domains known to coordinate the molybdopterin cofactor (MoCo). Pterins are bicyclic nitrogen-rich compounds, several of which are formed via a non-essential branch of the folate biosynthesis pathway, distinct from MoCo. The pterin-binding protein PruR controls DcpA activity, fostering cdGMP breakdown and dampening its synthesis. Pterins are excreted and we report here that PruR associates with these metabolites in the periplasm, promoting interaction with the DcpA periplasmic domain. The pteridine reductase PruA, which reduces specific dihydro-pterin molecules to their tetrahydro forms, imparts control over DcpA activity through PruR. Tetrahydromonapterin preferentially associates with PruR relative to other related pterins, and the PruR-DcpA interaction is decreased in a pruA mutant. PruR and DcpA are encoded in an operon that is conserved amongst multiple Proteobacteria including mammalian pathogens. Crystal structures reveal that PruR and several orthologs adopt a conserved fold, with a pterin-specific binding cleft that coordinates the bicyclic pterin ring. These findings define a new pterin-responsive regulatory mechanism that controls biofilm formation and related cdGMP-dependent phenotypes in A. tumefaciens and is found in multiple additional bacterial pathogens.

Methyl-coenzyme M reductase (MCR) is a central player in methane biogeochemistry, governing methanogenesis and the anaerobic oxidation of methane (AOM) in methanogens and anaerobic methanotrophs (ANME), respectively. The prosthetic group of MCR is coenzyme F 430 , a nickel-containing tetrapyrrole derivative. Additionally, a few modified versions of F 430 have been discovered, including the 17 2 -methylthio-F 430 (mt-F 430 ) that functions with ANME-1 MCR. This study employs molecular dynamics (MD) simulations to unravel the intricacies of the active-site dynamics of MCR from Methanosarcina acetivorans and ANME-1 when bound to the canonical F 430 compared to 17 2 -thioether coenzyme F 430 variants and substrates for methane formation. Overall, our simulations indicate that each MCR active site is optimized for a given version of F 430 and support the importance of the Gln to Val substitution in accommodating the 17 2 methylthio modification. Notably, modifications in the 17 2 position disrupt the canonical coordination among cofactors in M. acetivorans MCR, implicating structural perturbations, but evidence of active site reorganization to maintain substrate positions suggest that the modified F 430 s could be accommodated in a methanogenic MCR. We additionally report the first quantitative estimate of MCR intrinsic electric fields pivotal in driving methane formation. Our results suggest that the electric field aligned along the CH 3 -S-CoM thioether bond facilitates homolytic bond cleavage, coinciding with the proposed catalytic mechanism. Structural perturbations, however, weaken and misalign these electric fields, emphasizing the significance of the active site structure in maintaining their integrity. In conclusion, our results deepen the understanding of MCR active-site dynamics, the enzyme's organizational role in intrinsic electric fields for catalysis, and the interplay between active site structure and electrostatics. This work not only advances our comprehension of MCR functionality but also provides a foundation for future investigations employing sophisticated models to capture the complex electronic properties of MCR active sites quantitatively.

Abstract CADD ( c hlamydia protein a ssociating with d eath d omains) is a p -aminobenzoate synthase involved in a non-canonical route for tetrahydrofolate biosynthesis in the intracellular bacterial pathogen, Chlamydia trachomatis . The previously solved crystal structure revealed a seven-helix bundle architecture similar to heme oxygenase with a diiron active site, making CADD a founding member of the emerging HDO ( h eme-oxygenase-like d iiron o xidase) superfamily. The CADD-dependent route for pAB biosynthesis was shown to use L-tyrosine as a precursor, however, in vitro reactions were not stimulated by the addition of free L-tyrosine or other tyrosine-derived metabolites, leading to the proposal that the enzyme uses an internal active site tyrosine residue as a precursor to pAB. Here, we perform further biochemical characterization of CADD to clarify the details of the unique self-sacrificing reaction. Surprisingly, the pAB synthase reaction was shown to be dependent on manganese as opposed to iron and the data are most consistent with an active dimanganese cofactor analogous to class Ib and class Id ribonucleotide reductases. Experiments with 18 O 2 demonstrated the incorporation of two oxygen atoms from molecular oxygen into the pAB product, supporting the proposed mechanism requiring two monooxygenase reactions. Mass spectrometry-based proteomic analyses of CADD-derived peptides demonstrated a glycine substitution at Tyr27, a modification that was increased in reactions that produced pAB in vitro . Additionally, Lys152 was found to be deaminated and oxidized to aminoadipic acid. Taken together, our results support the conclusion that CADD is a manganese-dependent oxygenase that uses Tyr27 and possibly Lys152 as sacrificial substrates for pAB biosynthesis.