Abstract Glycoproteome profiling (glycoproteomics) is a powerful yet analytically challenging research tool. The complex tandem mass spectra generated from glycopeptide mixtures require sophisticated analysis pipelines for structural determination. Diverse software aiding the process have appeared, but their relative performance remains untested. Conducted through the HUPO Human Proteome Project – Human Glycoproteomics Initiative, this community study, comprising both developers and users of glycoproteomics software, evaluates the performance of informatics solutions for system-wide glycopeptide analysis. Mass spectrometry-based glycoproteomics datasets from human serum were shared with all teams. The relative team performance for N - and O -glycopeptide data analysis was comprehensively established and validated through orthogonal performance tests. Excitingly, several high-performance glycoproteomics informatics solutions were identified. While the study illustrated that significant informatics challenges remain, as indicated by a high discordance between annotated glycopeptides, lists of high-confidence (consensus) glycopeptides were compiled from the standardised team reports. Deep analysis of the performance data revealed key performance-associated search variables and led to recommendations for improved “high coverage” and “high accuracy” glycoproteomics search strategies. This study concludes that diverse software for comprehensive glycopeptide data analysis exist, points to several high-performance search strategies, and specifies key variables that may guide future software developments and assist informatics decision-making in glycoproteomics.

The non-structural protein 1 (NS1) of dengue virus (DENV) contains two highly conserved N-glycosylation sites at positions 130 and 207 (N130 and N207). Intracellular NS1 monomers and homo-dimers participate in viral RNA replication within membrane-bound replication complexes. Soluble multimeric NS1 (sNS1) is secreted into the extracellular milieu and represents an important virulence factor for DENV through its ability to interfere with the host complement activation cascade and to induce vascular leakage. The role of the two N-glycans in NS1 biological activities, however, has not been carefully examined. Here, stable DENV2 mutants that lack glycan at either N sites of NS1 were engineered. We showed that the lack of glycans at either N site of NS1 did not impair viral replication nor viral output in both mosquito and mammalian cell lines. In contrast, while N130 de-glycosylated DENV displayed parental in vivo fitness in IFNAR-/- mice, the N207 de-glycosylated mutant was significantly attenuated as evidenced by 100% survival rate, which correlated with accelerated viral clearance in circulation. sNS1-depletion, sNS1 exogenous administration and co-infection experiments supported that N207 de-glycosylated NS1 exerted a dominant attenuating effect during in vivo infection. Bulk RNAseq, inflammatory cytokine profile, immune phenotyping of neutrophils and T cells, immune cell depletion and immune checkpoint blockade approaches led us to propose that N207 de-glycosylated NS1 limited CD8+ T cell apoptosis mediated by the PD-L1/PD-1 axis, thereby improving viral clearance efficacy. This work uncovers a novel immune evasion strategy where N207 glycans on NS1 prevent the protein from exerting immune modulation activity that would be detrimental to DENV.

N-glycosylation can have a profound effect on the quality of mAb therapeutics. In biomanufacturing, one of the ways to influence N-glycosylation patterns is by altering the media used to grow mAb cell expression systems. Here, we explore the potential of machine learning (ML) to forecast the abundances of N-glycan types based on variables related to the growth media. The ML models exploit a dataset consisting of detailed glycomic characterisation of Anti-HER fed-batch bioreactor cell cultures measured daily under 12 different culture conditions, such as changes in levels of dissolved oxygen, pH, temperature, and the use of two different commercially available media. By performing spent media quantitation and subsequent calculation of pseudo cell consumption rates (termed media markers) as inputs to the ML model, we were able to demonstrate a small subset of media markers (18 selected out of 167 mass spectrometry peaks) in a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell cultures are important to model N-glycan relative abundances (Regression - correlations between 0.80-0.92; Classification - AUC between 75.0-97.2). The performances suggest the ML models can infer N-glycan critical quality attributes from extracellular media as a proxy. Given its accuracy, we envisage its potential applications in biomaufactucuring, especially in areas of process development, downstream and upstream bioprocessing.