Abstract Base stacking interactions between adjacent bases in DNA and RNA are known to be important for many biological processes, for drug development, and in other biotechnology applications. While previous work has estimated base stacking energies between pairs of bases, the individual contributions of each base to the stacking interaction has remained unknown. Here, we developed a novel methodology using a custom Centrifuge Force Microscope to perform high-throughput single molecule experiments to measure base stacking energies between individual adjacent bases. We found stacking energies strongest between purines (G|A at −2.3 ± 0.2 kcal/mol) and weakest between pyrimidines (C|T at −0.4 ± 0.1 kcal/mol). Hybrid stacking with phosphorylated, methylated, and RNA bases had no measurable effect, but a fluorophore modification reduced stacking energy. The implications of the work are demonstrated with three applications. We experimentally show that base stacking design can influence assembly and stability of a DNA nanostructure, modulate kinetics of enzymatic ligation, and determine accuracy of force fields in molecular dynamics (MD) simulations. Our results provide new insights into fundamental DNA interactions that are critical in biology and can inform rational design in diverse biotechnology applications.

Abstract Synthetic DNA motifs form the basis of nucleic acid nanotechnology. The biochemical and biophysical properties of these motifs determine their applications. Here, we present a detailed characterization of switchback DNA, a globally left-handed structure composed of two parallel DNA strands. Compared to a conventional duplex, switchback DNA shows lower thermodynamic stability and requires higher magnesium concentration for assembly but exhibits enhanced biostability against some nucleases. Strand competition and strand displacement experiments show that component sequences have an absolute preference for duplex complements instead of their switchback partners. Further, we hypothesize a potential role for switchback DNA as an alternate structure in sequences containing short tandem repeats. Together with small molecule binding experiments and cell studies, our results open new avenues for switchback DNA in biology and nanotechnology.

Abstract Post-transcriptional modifications in RNA can significantly impact their structure and function. In particular, transfer RNAs (tRNAs) are heavily modified, with around 100 different naturally occurring nucleotide modifications contributing to codon bias and decoding efficiency. Here, we describe our efforts to investigate the impact of RNA modifications on the structure and stability of tRNA Phenylalanine (tRNA Phe ) from S. cerevisiae using molecular dynamics (MD) simulations. Through temperature replica exchange MD (T-REMD) studies, we explored the unfolding pathway to understand how RNA modifications influence the conformational dynamics of tRNA Phe , both in the presence and absence of magnesium ions (Mg 2+ ). We observe that modified nucleotides in key regions of the tRNA establish a complex network of hydrogen bonds and stacking interactions which is essential for tertiary structure stability of the tRNA. Furthermore, our simulations show that modifications facilitate the formation of ion binding sites on the tRNA. However, high concentrations of Mg 2+ ions can stabilize the tRNA tertiary structure in the absence of modifications. Our findings illuminate the intricate interactions between modifications, magnesium ions, and RNA structural stability. Graphical Abstract

Spinocerebellar ataxias (SCAs) are a genetically heterogenous group of devastating neurodegenerative conditions for which clinical care currently focuses on managing symptoms. Across these diseases there is an unmet need for therapies that address underlying disease mechanisms. We utilised the shared CAG repeat expansion mutation causative for a large subgroup of SCAs, to develop a novel disease-gene independent and mechanism agnostic small molecule screening approach to identify compounds with therapeutic potential across multiple SCAs. Using this approach, we identified the FDA approved microtubule inhibitor Colchicine and a novel CAG-repeat binding compound that reduce expression of disease associated transcripts across SCA1, 3 and 7 patient derived fibroblast lines and the

ABSTRACT Myotonic dystrophy is a multisystemic neuromuscular disease caused by either a CTG repeat expansion in DMPK (DM1) or a CCTG repeat expansion in CNBP (DM2). Transcription of the expanded alleles produces toxic gain-of-function RNA that sequester the MBNL family of alternative splicing regulators into ribonuclear foci, leading to pathogenic mis-splicing. There are currently no approved treatments that target the root cause of disease which is the production of the toxic expansion RNA molecules. In this study, using our previously established HeLa DM1 repeat selective screening platform, we identified the natural product quercetin as a selective modulator of toxic RNA levels. Quercetin treatment selectively reduced toxic RNA levels and rescued MBNL dependent mis-splicing in DM1 and DM2 patient derived cell lines and in the HSA LR transgenic DM1 mouse model where rescue of myotonia was also observed. Based on our data and its safety profile for use in humans, we have identified quercetin as a priority disease-targeting therapeutic lead for clinical evaluation for the treatment of DM1 and DM2. One Sentence Summary The natural product quercetin reduces toxic RNA in myotonic dystrophy.

Alternative splicing (AS) of Exon 11 of the Insulin Receptor (

Synthetic DNA motifs form the basis of nucleic acid nanotechnology, and their biochemical and biophysical properties determine their applications. Here, we present a detailed characterization of switchback DNA, a globally left-handed structure composed of two parallel DNA strands. Compared to a conventional duplex, switchback DNA shows lower thermodynamic stability and requires higher magnesium concentration for assembly, but exhibits a higher biostability against some nucleases. Strand competition and strand displacement experiments show that component sequences have an absolute preference for duplex complements instead of their switchback partners. Further, we hypothesize a potential role for switchback DNA as an alternate structure for short-tandem repeats involved in repeat-expansion diseases. Together with small molecule binding experiments and cell studies, our results open new avenues for synthetic DNA motifs in biology and nanotechnology.