In 2008 we published the first set of guidelines for standardizing research in autophagy. Since then, research on this topic has continued to accelerate, and many new scientists have entered the field. Our knowledge base and relevant new technologies have also been expanding. Accordingly, it is important to update these guidelines for monitoring autophagy in different organisms. Various reviews have described the range of assays that have been used for this purpose. Nevertheless, there continues to be confusion regarding acceptable methods to measure autophagy, especially in multicellular eukaryotes. A key point that needs to be emphasized is that there is a difference between measurements that monitor the numbers or volume of autophagic elements (e.g., autophagosomes or autolysosomes) at any stage of the autophagic process vs. those that measure flux through the autophagy pathway (i.e., the complete process); thus, a block in macroautophagy that results in autophagosome accumulation needs to be differentiated from stimuli that result in increased autophagic activity, defined as increased autophagy induction coupled with increased delivery to, and degradation within, lysosomes (in most higher eukaryotes and some protists such as Dictyostelium) or the vacuole (in plants and fungi). In other words, it is especially important that investigators new to the field understand that the appearance of more autophagosomes does not necessarily equate with more autophagy. In fact, in many cases, autophagosomes accumulate because of a block in trafficking to lysosomes without a concomitant change in autophagosome biogenesis, whereas an increase in autolysosomes may reflect a reduction in degradative activity. Here, we present a set of guidelines for the selection and interpretation of methods for use by investigators who aim to examine macroautophagy and related processes, as well as for reviewers who need to provide realistic and reasonable critiques of papers that are focused on these processes. These guidelines are not meant to be a formulaic set of rules, because the appropriate assays depend in part on the question being asked and the system being used. In addition, we emphasize that no individual assay is guaranteed to be the most appropriate one in every situation, and we strongly recommend the use of multiple assays to monitor autophagy. In these guidelines, we consider these various methods of assessing autophagy and what information can, or cannot, be obtained from them. Finally, by discussing the merits and limits of particular autophagy assays, we hope to encourage technical innovation in the field.

AMPK ensures cell survival during energetic stress by stimulating the kinase Akt through mTORC2.

Abstract Glucocorticoids promote muscle atrophy by inducing a class of proteins called atrogenes, resulting in reductions in muscle size and strength. In this work, we evaluated whether a mouse model with pre-existing diet-induced obesity had altered glucocorticoid responsiveness. We observed that all animals treated with the synthetic glucocorticoid dexamethasone had reduced strength, but that obesity exacerbated this effect. These changes were concordant with more pronounced reductions in muscle size, particularly in Type II muscle fibers, and potentiated induction of atrogene expression in the obese mice relative to lean mice. Furthermore, we show that the reductions in lean mass do not fully account for the dexamethasone-induced insulin resistance observed in these mice. Together these data suggest that obesity potentiates glucocorticoid-induced muscle atrophy.

Abstract The mechanistic target of rapamycin (mTORC1) is a nutrient responsive protein kinase complex that helps co-ordinate anabolic processes across all tissues. There is evidence that signaling through mTORC1 in skeletal muscle may be a determinant of energy expenditure and aging and therefore components downstream of mTORC1 signaling may be potential targets for treating obesity and age-associated metabolic disease. Here, we generated mice with Ckmm-Cre driven ablation of Tsc1 , which confers constitutive activation of mTORC1 in skeletal muscle and performed unbiased transcriptional analyses to identify pathways and candidate genes that may explain how skeletal muscle mTORC1 activity regulates energy balance and aging. Activation of skeletal muscle mTORC1 produced a striking resistance to diet-and age-induced obesity without inducing systemic insulin resistance. We found that increases in energy expenditure following a high fat diet were mTORC1-dependent and that elevated energy expenditure caused by ablation of Tsc1 coincided with the upregulation of skeletal muscle-specific thermogenic mechanisms that involve sarcolipin-driven futile cycling of Ca 2+ through SERCA2. Additionally, we report that constitutive activation of mTORC1 in skeletal muscle reduces lifespan. These findings support the hypothesis that activation of mTORC1 and its downstream targets, specifically in skeletal muscle, may play a role in nutrient-dependent thermogenesis and aging.

Summary Almost all effective treatments for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) involve reduction of adiposity, which suggests the metabolic axis between liver and adipose tissue is essential to NAFLD development. Since excessive dietary sugar intake may be an initiating factor for NAFLD, we have characterized the metabolic effects of liquid sucrose intake at concentrations relevant to typical human consumption in mice. We report that sucrose intake induces sexually dimorphic effects in liver, adipose tissue, and the microbiome; differences concordant with steatosis severity. We show that when steatosis is decoupled from impairments in insulin responsiveness, sex is a moderating factor that influences sucrose-driven lipid storage and the contribution of de novo fatty acid synthesis to the overall hepatic triglyceride pool. Our findings provide physiologic insight into how sex influences the regulation of adipose-liver crosstalk and highlight the importance of extrahepatic metabolism in the pathogenesis of diet-induced steatosis and NAFLD.

Abstract The timing of food intake is a novel dietary component that can impact health. Time-restricted feeding (TRF), a form of intermittent fasting, manipulates food timing. During pregnancy, one may experience disruptions to food intake for diverse reasons (e.g. nausea and vomiting of pregnancy, food insecurity, desire to manage gestational weight gain, disordered eating behaviors, changes in taste and food preferences, etc) and therefore may experience periods of intentional or unintentional fasting similar to TRF protocols. Because interest in TRF is gaining popularity and feeding may be interrupted in those who are pregnant, it is important to understand the long-term effects of TRF during pregnancy on the resultant offspring. Using a mouse model, we tested the effects of gestational exposure to early TRF (eTRF) over the life course of both male and female offspring. Offspring body composition was similar between experimental groups in both males and females from weaning (day 21) to adulthood (day 70), with minor increases in food intake in eTRF females and improved glucose tolerance in males. After 10 weeks of high fat, high sucrose diet feeding, male eTRF offspring were more sensitive to insulin but developed glucose intolerance with impaired insulin secretion. As such, gestational eTRF causes sex-specific deleterious effects on glucose homeostasis after chronic high fat, high sucrose diet feeding in male offspring. Further studies are needed to determine the effect gestational eTRF has on the male pancreas as well as to elucidate the mechanisms that protect females from this metabolic dysfunction.

Abstract Human milk is the recommended nutrient source for newborns. The mammary gland comprises multiple cell types including epithelial cells and adipocytes. The contributions of mammary adipocytes to breast milk composition and the intersections between mammary nutrient sensing and milk lipids are not fully understood. A major nutrient sensor in most tissues is the mechanistic target of rapamycin 1 (mTORC1). To assess the role of excess nutrient sensing on mammary gland structure, function, milk composition, and offspring weights, we used an Adiponectin-Cre driven Tsc1 knockout model of adipocyte mTORC1 hyperactivation. Our results show that the knockout dams have higher milk fat contributing to higher milk caloric density and heavier offspring weight during lactation. Additionally, milk of knockout dams displayed a lower percentage of saturated fatty acids, higher percentage of monounsaturated fatty acids, and a lower milk ω6: ω3 ratio driven by increases in docosahexaenoic acid (DHA). Mammary gland gene expression analyses identified changes in eicosanoid metabolism, adaptive immune function, and contractile gene expression. Together, these results suggest a novel role of adipocyte mTORC1 in mammary gland function and morphology, milk composition, and offspring growth.

Alzheimer's disease (AD) is a prevalent and costly age-related dementia. Heritable factors account for 58-79% of variation in late-onset AD, but substantial variation remains in age-of-onset, disease severity, and whether those with high-risk genotypes acquire AD. To emulate the diversity seen in human populations, we utilized the AD-BXD mouse panel. This genetically diverse resource combines AD genotypes with multiple BXD strains to discover new genetic drivers of AD resilience. By comparing AD-BXD carriers to noncarrier littermates, we computed a novel quantitative metric for resilience to cognitive decline in the AD-BXD. Our quantitative AD resilience trait was heritable and genetic mapping identified a locus on chr8 associated with resilience to AD. Using a hippocampus proteomics dataset, we nominated the mitochondrial glutathione S reductase protein (GR or GSHR) as a resilience factor, finding that the DBA/2J genotype was associated with a substantially higher level of GR expression. By mapping protein QTLs (pQTLs), we identified synaptic organization and mitochondrial proteins coregulated in trans with a cis-pQTL for GR. Using the paraclique enrichment method, we found four coexpression modules related to cell structure, protein folding, and postsynaptic densities that correlated with the quantitative resilience score in aged 5XFAD mice. Finally, we found significant positive associations between human GSR transcript abundance in the brain and better outcomes on AD-related cognitive and pathology traits in the Religious Orders Study/Memory and Aging project (ROSMAP). Taken together, these data support a framework for resilience in which neuronal antioxidant pathway activity provides for stability of synapses within the hippocampus.

Myogenesis is an important process during both development and muscle repair. Previous studies suggest that mTORC1 plays a role in the formation of mature muscle from immature muscle precursor cells. Here we show that gene expression for several myogenic transcription factors including Myf5, Myog and Mef2c but not MyoD and myosin heavy chain isoforms decrease when C2C12 cells are treated with rapamycin, supporting a role for mTORC1 pathway during muscle development. To investigate the possibility that mTORC1 can regulate muscle in vivo we ablated the essential dTORC1 subunit Raptor in Drosophila melanogaster and found that muscle-specific knockdown of Raptor causes flies to be too weak to emerge from their pupal cases during eclosion. Using a series of GAL4 drivers we also show that muscle-specific Raptor knockdown also causes shortened lifespan, even when eclosure is unaffected. Together these results highlight an important role for TORC1 in muscle development, integrity and function in both Drosophila and mammalian cells.