Summary The skin epithelium acts as the barrier between an organism’s internal and external environments. In zebrafish and other freshwater organisms, this barrier function requires withstanding a large osmotic pressure differential. Wounds breach this epithelium, causing a large disruption to the tissue microenvironment due to the mixing of isotonic interstitial fluid with the external hypotonic fresh water. Here we show that, following acute injury, the larval zebrafish epidermis undergoes a dramatic fissuring process that resembles hydraulic fracturing, driven by the influx of external fluid. The fissuring starts in the basal epidermal layer nearest to the wound, and then propagates at a constant rate through the tissue spanning over one hundred micrometers; during this process the outermost superficial epidermal layer remains intact. Fissuring is completely inhibited when larvae are wounded in an isotonic external media, suggesting that osmotic pressure gradients drive fissure. Additionally, fissuring partially depends on myosin II activity, as its inhibition reduces fissure propagation away from the wound. During and after fissuring, the basal layer forms large macropinosomes (with cross-sectional areas ranging from 1-10 µm 2 ), presumably to clear the excess fluid. We conclude that excess external fluid entry through the wound and subsequent closure of the wound through actomyosin purse string contraction in the superficial cell layer causes fluid pressure buildup in the extracellular space of the zebrafish epidermis. This excess fluid pressure causes tissue to fissure, and eventually the fluid is cleared through macropinocytosis.

Abstract The ability of epithelial tissues to heal after injury is essential for animal life, yet the mechanisms by which epithelial cells sense tissue damage are incompletely understood. In aquatic organisms such as zebrafish, osmotic shock following injury is believed to be an early and potent activator of a wound response. We find that, in addition to sensing osmolarity, basal skin cells in zebrafish larvae are also sensitive to changes in the particular ionic composition of their surroundings after wounding, specifically the concentration of sodium chloride in the immediate vicinity of the wound. This sodium chloride-specific wound detection mechanism is independent of cell swelling, and instead is suggestive of a mechanism by which cells sense changes in the transepithelial electrical potential generated by the transport of sodium and chloride ions across the skin. Consistent with this hypothesis, we show that electric fields directly applied within the skin are sufficient to initiate actin polarization and migration of basal cells in their native epithelial context in vivo , even overriding endogenous wound signaling. This suggests that, in order to mount a robust wound response, skin cells respond to both osmotic and electrical perturbations arising from tissue injury.

ABSTRACT Controlling intracellular osmolarity is essential to all cellular life. Cells that live in hypo-osmotic environments like freshwater must constantly battle water influx to avoid swelling until they burst. Many eukaryotic cells use contractile vacuoles to collect excess water from the cytosol and pump it out of the cell. Although contractile vacuoles are essential to many species, including important pathogens, the mechanisms that control their dynamics remain unclear. To identify basic principles governing contractile vacuole function, we here investigate the molecular mechanisms of two species with distinct vacuolar morphologies from different eukaryotic lineages—the discoban Naegleria gruberi , and the amoebozoan slime mold Dictyostelium discoideum . Using quantitative cell biology we find that, although these species respond differently to osmotic challenges, they both use actin for osmoregulation, as well as vacuolar-type proton pumps for filling contractile vacuoles. We also use analytical modeling to show that cytoplasmic pressure is sufficient to drive water out of contractile vacuoles in these species, similar to findings from the alveolate Paramecium multimicronucleatum . Because these three lineages diverged well over a billion years ago, we propose that this represents an ancient eukaryotic mechanism of osmoregulation.

Diverse eukaryotic cells assemble microtubule networks that vary in structure and composition. While we understand how cells build microtubule networks with specialized functions, we do not know how microtubule networks diversify across deep evolutionary timescales. This problem has remained unresolved because most organisms use shared pools of tubulins for multiple networks, making it impossible to trace the evolution of any single network. In contrast, the amoeboflagellate Naegleria uses distinct tubulin genes to build distinct microtubule networks: while Naegleria builds flagella from conserved tubulins during differentiation, it uses divergent tubulins to build its mitotic spindle. This genetic separation makes for an internally controlled system to study independent microtubule networks in a single organismal and genomic context. To explore the evolution of these microtubule networks, we identified conserved microtubule binding proteins and used transcriptional profiling of mitosis and differentiation to determine which are upregulated during the assembly of each network. Surprisingly, most microtubule binding proteins are upregulated during only one process, suggesting that Naegleria uses distinct component pools to specialize its microtubule networks. Furthermore, the divergent residues of mitotic tubulins tend to fall within the binding sites of differentiation-specific microtubule regulators, suggesting that interactions between microtubules and their binding proteins constrain tubulin sequence diversification. We therefore propose a model for cytoskeletal evolution in which pools of microtubule network components constrain and guide the diversification of the entire network, so that the evolution of tubulin is inextricably linked to that of its binding partners.