ABSTRACT DNA nanotechnology has paved the way for new generations of programmable nanomaterials. Utilising the DNA origami technique, various DNA constructs can be designed, ranging from single tiles to the self-assembly of large-scale complex multi-tile arrays. These DNA nanostructures have enabled new applications in biosensing, drug delivery and other multifunctional materials. In this study, we demonstrate real-time, non-destructive and label-free fingerprinting of higher-order assemblies of DNA origami nanostructures using solid-state nanopores. Using this approach, we quantify the assembly yields for each DNA origami nanostructure with single-entity resolution using the nanostructure-induced charge introduced in the nanopore as a discriminant. We compare the assembly yield of the supramolecular DNA nanostructures obtained with the nanopore with agarose gel electrophoresis and AFM imaging and demonstrate that the nanopore system can provide enhanced information about the nanostructures. We envision that this nanopore detection platform can be applied to a range of nanomaterial designs and enable the analysis and manipulation of large DNA assemblies in real-time with single-molecule resolution. STATEMENT OF SIGNIFICANCE We demonstrate a single molecule high-throughput approach for the analysis of higher-order DNA origami assemblies with a crowded nanopore. The technique enables the characterisation of DNA origami nanostructures at statistically relevant numbers in real-time and at single-molecule resolution while being non-destructive and label-free, and without the requirement of lengthy sample preparations or use of expensive reagents. We exemplify the technique by demonstrating the quantification of the assembly yield of DNA origami nanostructures based on their equivalent charge surplus computed from the ion current signals recorded. Compared to the standard analysis methods of AFM and agarose gel electrophoresis, the nanopore measurements provides enhanced information about the nanostructures.

Solid-state nanopores represent an emerging technology for the highly sensitive detection of biomolecular markers, but the detection of DNA point mutations is challenged by the high noise levels associated with solid-state nanopore reading. In contrast, barcoded DNA origami nanostructures can provide unique single-molecule nanopore fingerprints. In this work, we have integrated nanopore-barcoded DNA nanostructures with enzymatic DNA ligation, the latter of which is routinely involved in clinical protocols for DNA mutation detection. We designed two triangular DNA origami variants containing three elongated staples that provide strands extensions on one side that are complementary to a target sequence. Addition of the latter in solution promotes the formation of a DNA triangle dimer. Since T4 DNA ligase repairs a nick in a dsDNA segment only if there is Watson-Crick base-pairing at the nick, the two DNA triangles can be covalently linked only if the DNA sequence bridging the two triangles carries the targeted mutation. We have found striking differences between ligation detection by gel electrophoresis, AFM, and quartz capillary-based nanopores. The stacking interaction between DNA triangles is enhanced by the formation of dimers, and promote the formation of higher order nanostructure, which serve as molecular weight amplification for DNA ligation in gels. The triangle-triangle stacking dynamics presumably involves a clam-like folding mechanism, which is detectable by quartz nanopore analysis, and which hinders ligation by T4 DNA ligase. The results provide the basis for development of rapid, highly sensitive, and affordable high-throughput approaches for profiling genetic variations in point-of-care settings.

ABSTRACT Nanopore sensing is a technique based on the Coulter principle to analyze and characterize nanoscale materials with single entity resolution. However, its use in nanoparticle characterization has been constrained by the need to tailor the nanopore aperture size to the size of the analyte, precluding the analysis of heterogenous samples. Additionally, nanopore sensors often require the use of high salt concentrations to improve the signal-to-noise ratio, which further limits their ability to study a wide range of nanoparticles that are unstable at high ionic strength. Here, we report the development of nanopore sensors enhanced by a polymer electrolyte system, enabling the analysis of heterogenous nanoparticle mixtures at low ionic strength. We present a finite element model to explain the anomalous conductive/resistive pulse signals observed and compare these results with experiments. Furthermore, we demonstrate the wide applicability of the method by characterizing metallic nanospheres of varied sizes, plasmonic nanostars with various degrees of branching, and protein-based spherical nucleic acids with different oligonucleotide loadings. Our system will complement the toolbox of nanomaterials characterization techniques and will enable real-time optimization workflow for engineering a wide range of nanomaterials.