We have designed and tested a family of silicon nitride cantilevers ranging in length from 23 to 203 μm. For each, we measured the frequency spectrum of thermal motion in air and water. Spring constants derived from thermal motion data agreed fairly well with the added mass method; these and the resonant frequencies showed the expected increase with decreasing cantilever length. The effective cantilever density (calculated from the resonant frequencies) was 5.0 g/cm3, substantially affected by the mass of the reflective gold coating. In water, resonant frequencies were 2 to 5 times lower and damping was 9 to 24 times higher than in air. Thermal motion at the resonant frequency, a measure of noise in tapping mode atomic force microscopy, decreased about two orders of magnitude from the longest to the shortest cantilever. The advantages of the high resonant frequency and low noise of a short (30 μm) cantilever were demonstrated in tapping mode imaging of a protein sample in buffer. Low-noise images were taken with feedback at a rate of about 0.5 frames/s. Given proper setpoint adjustment, the sample was not damaged, despite this cantilever’s high spring constant of 1.3 N/m. Without feedback, images were taken at 1.5 frames/s.

Despite its importance in biological phenomena, a comprehensive understanding of the mechanism of amyloid formation remains elusive. Here, we use atomic force microscopy to map the formation of β2-microglobulin amyloid fibrils with distinct morphologies and persistence lengths, when protein concentration, pH and ionic strength are varied. Using the resulting state-diagrams, we demonstrate the existence of two distinct competitive pathways of assembly, which define an energy landscape that rationalises the sensitivity of fibril morphology on the solution conditions. Importantly, we show that semi-flexible (worm-like) fibrils, which form rapidly during assembly, are kinetically trapped species, formed via a non-nucleated pathway that is explicitly distinct from that leading to the formation of the relatively rigid long-straight fibrils classically associated with amyloid. These semi-flexible fibrils also share an antibody epitope common to other protein oligomers that are known to be toxic species linked to human disease. The results demonstrate the heterogeneity of amyloid assembly, and have important implications for our understanding of the importance of oligomeric states in amyloid disease, the origins of prion strains, and the development of therapeutic strategies.

Solid-state nanopores represent an emerging technology for the highly sensitive detection of biomolecular markers, but the detection of DNA point mutations is challenged by the high noise levels associated with solid-state nanopore reading. In contrast, barcoded DNA origami nanostructures can provide unique single-molecule nanopore fingerprints. In this work, we have integrated nanopore-barcoded DNA nanostructures with enzymatic DNA ligation, the latter of which is routinely involved in clinical protocols for DNA mutation detection. We designed two triangular DNA origami variants containing three elongated staples that provide strands extensions on one side that are complementary to a target sequence. Addition of the latter in solution promotes the formation of a DNA triangle dimer. Since T4 DNA ligase repairs a nick in a dsDNA segment only if there is Watson-Crick base-pairing at the nick, the two DNA triangles can be covalently linked only if the DNA sequence bridging the two triangles carries the targeted mutation. We have found striking differences between ligation detection by gel electrophoresis, AFM, and quartz capillary-based nanopores. The stacking interaction between DNA triangles is enhanced by the formation of dimers, and promote the formation of higher order nanostructure, which serve as molecular weight amplification for DNA ligation in gels. The triangle-triangle stacking dynamics presumably involves a clam-like folding mechanism, which is detectable by quartz nanopore analysis, and which hinders ligation by T4 DNA ligase. The results provide the basis for development of rapid, highly sensitive, and affordable high-throughput approaches for profiling genetic variations in point-of-care settings.