The DNAJ-PKAc fusion kinase is a defining feature of the adolescent liver cancer fibrolamellar carcinoma (FLC). A single lesion on chromosome 19 generates this mutant kinase by creating a fused gene encoding the chaperonin binding domain of Hsp40 (DNAJ) in frame with the catalytic core of protein kinase A (PKAc). FLC tumors are notoriously resistant to standard chemotherapies. Aberrant kinase activity is assumed to be a contributing factor. Yet recruitment of binding partners, such as the chaperone Hsp70, implies that the scaffolding function of DNAJ- PKAc may also underlie pathogenesis. By combining proximity proteomics with biochemical analyses and photoactivation live-cell imaging we demonstrate that DNAJ-PKAc is not constrained by A-kinase anchoring proteins. Consequently, the fusion kinase phosphorylates a unique array of substrates. One validated DNAJ-PKAc target is the Bcl-2 associated athanogene 2 (BAG2), a co-chaperone recruited to the fusion kinase through association with Hsp70. Immunoblot and immunohistochemical analyses of FLC patient samples correlate increased levels of BAG2 with advanced disease and metastatic recurrences. BAG2 is linked to Bcl-2, an anti-apoptotic factor that delays cell death. Pharmacological approaches tested if the DNAJ- PKAc/Hsp70/BAG2 axis contributes to chemotherapeutic resistance in AML12 DNAJ-PKAc hepatocyte cell lines using the DNA damaging agent etoposide and the Bcl-2 inhibitor navitoclax. Wildtype AML12 cells were susceptible to each drug alone and in combination. In contrast, AML12 DNAJ-PKAc cells were moderately affected by etoposide, resistant to navitoclax, but markedly susceptible to the drug combination. These studies implicate BAG2 as a biomarker for advanced FLC and a chemotherapeutic resistance factor in DNAJ-PKAc signaling scaffolds.

Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) incidence is increasing worldwide due to the obesity epidemic, which drives metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH) that can lead to HCC. However, the molecular pathways that lead to MASH-HCC are poorly understood. We have previously reported that male mice with global haploinsufficiency of hypoxia-associated factor, HAF (SART1+/-) spontaneously develop MASH/HCC. However, the cell type(s) responsible for HCC associated with HAF loss are unclear. Results. SART1-floxed mice were crossed with mice expressing Cre-recombinase within hepatocytes (Alb-Cre; hepS-/-) or macrophages (LysM-Cre, macS-/-). Only hepS-/- mice (both male and female) developed HCC suggesting that HAF protects against HCC primarily within hepatocytes. HAF-deficient macrophages showed decreased P-p65 and P-p50 and in many major components of the NF-κB pathway, which was recapitulated using HAF siRNA in vitro. HAF depletion increased apoptosis both in vitro and in vivo, suggesting that HAF mediates a tumor suppressor role by suppressing hepatocyte apoptosis. We show that HAF regulates NF-κB activity by controlling transcription of TRADD and RIPK1. Mice fed a high-fat diet (HFD) showed marked suppression of HAF, P-p65 and TRADD within their livers after 26 weeks, but manifest profound upregulation of HAF, P-65 and TRADD within their livers after 40 weeks of HFD, implicating deregulation of the HAF-NF-κB axis in the progression to MASH. In humans, HAF was significantly decreased in livers with simple steatosis but significantly increased in HCC compared to normal liver. Conclusions: HAF is novel transcriptional regulator of the NF-κB pathway that protects against hepatocyte apoptosis and is a key determinant of cell fate during progression to MASH and MASH-HCC.

Kinase-dependent signaling networks are frequently dysregulated in cancer, driving disease progression. While kinase inhibition has become an important therapeutic approach many cancers resist drug treatment. Therefore, we need both reliable biomarkers that predict drug responses and new targets to overcome drug resistance. Determining the kinase(s) that control cancer progression in individual cancers can pose a significant challenge. Genomics has identified important, yet limited numbers of kinase driver mutations. Transcriptomics can quantify aberrant gene expression, but it cannot measure the protein phosphorylation that regulates kinase-dependent signaling network activity. Proteomics measures protein expression and phosphorylation and, therefore, quantifies aberrant signaling network activity directly. We developed a kinome-centric pharmacoproteomics platform to study signaling pathways that determine cancer drug response. Using hepatocellular carcinoma (HCC) as our model, we determined kinome activity with kinobead/LC-MS profiling, and screened 299 kinase inhibitors for growth inhibition. Integrating kinome activity with drug responses, we obtained a comprehensive database of predictive biomarkers, and kinase targets that promote drug sensitivity and resistance. Our dataset specified pathway-based biomarkers for the clinical HCC drugs sorafenib, regorafenib and lenvatinib, and we found these biomarkers enriched in human HCC specimens. Strikingly, our database also revealed signaling pathways that promote HCC cell epithelial-mesenchymal transition (EMT) and drug resistance, and that NUAK1 and NUAK2 regulate these pathways. Inhibition of these kinases reversed the EMT and sensitized HCC cells to kinase inhibition. These results demonstrate that our kinome pharmacoproteomics platform discovers both predictive biomarkers for personalized oncology and novel cancer drug targets.

ABSTRACT Cells utilize protein-protein interaction (PPI) networks to receive, transduce, and respond to stimuli. Interaction network rewiring drives devastating diseases like cancers, making PPIs attractive targets for pharmacological intervention. Kinases are druggable nodes in PPI networks but high-throughput proteomics approaches to quantify disease-associated kinome PPI rewiring are lacking. We introduce kinobead competition and correlation analysis (Ki-CCA), a chemoproteomics approach to simultaneously map hundreds of endogenous kinase PPIs. We identified 2,305 PPIs of 300 kinases across 18 diverse cancer lines, quantifying the high plasticity of interaction networks between cancer types, signaling, and phenotypic states; this database of dynamic kinome PPIs provides deep insights into cancer cell signaling. We discovered an AAK1 complex promoting epithelial-mesenchymal transition and drug resistance, and depleting its components sensitized cells to targeted therapy. Ki-CCA enables rapid and highly multiplexed mapping of kinome PPIs in native cell and tissue lysates, without epitope tagged baits, protein labeling, or antibodies.

Abstract Mutations in the catalytic subunit of protein kinase A (PKAc) drive the stress hormone disorder adrenal Cushing’s syndrome. Here we define mechanisms of action for the PKAc-L205R and W196R variants. Both Cushing’s mutants are excluded from A kinase anchoring protein (AKAP) signaling islands and consequently diffuse throughout the cell. Kinase-dead experiments show that PKA activity is required for cortisol hypersecretion. However, kinase activation is not sufficient, as only cAMP analog drugs that displace native PKAc from AKAPs enhance cortisol release. Rescue experiments that incorporate mutant PKAc into AKAP signaling islands abolish cortisol overproduction, indicating that kinase anchoring restores normal endocrine function. Phosphoproteomics show that PKAc-L205R and W196R engage different mitogenic signaling pathways. ERK activity is elevated in adrenal-specific PKAc-W196R knock-in mice. Conversely, PKAc-L205R attenuates Hippo signaling, thereby upregulating the YAP/TAZ transcriptional co-activators. Thus, aberrant localization of each Cushing’s variant promotes the transmission of a distinct downstream pathogenic signal.