ABSTRACT We determined the transcription profile of AAV2-infected primary human fibroblasts. Subsequent analysis revealed that cells respond to AAV infection through changes in several significantly affected pathways including cell cycle regulation, chromatin modulation, and innate immune responses. Various assays were performed to validate selected differentially expressed genes and confirmed not only the quality but also the robustness of the raw data. One of the genes upregulated in AAV2 infected cells was the interferon-ɣ inducible factor 16 (IFI16). IFI16 is known as a multifunctional cytosolic and nuclear innate immune sensor for double-stranded, as well as single-stranded DNA, exerting its effects through various mechanisms, such as interferon response, epigenetic modifications, or transcriptional regulation. IFI16 thereby constitutes a restriction factor for many different viruses amongst them, as shown here, AAV2 and thereof derived vectors. Indeed, the post-transcriptional silencing of IFI16 significantly increased AAV2 transduction efficiency, independent of the structure of the virus/vector genome. We also show that IFI16 exerts its inhibitory effect on AAV2 transduction in an immune-modulatory independent way, by interfering with Sp1-dependent transactivation of wild-type AAV2 and AAV2 vector promoters. IMPORTANCE Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most frequently used viral vectors for gene therapy. The lack of pathogenicity of the parental virus, the long-term persistence as episomes in non-proliferating cells, and the availability of a variety of AAV serotypes differing in their cellular tropism are advantageous features of this biological nanoparticle. To deepen our understanding of virus-host interactions, especially in terms of innate immune responses, we present here the first transcriptome analysis of AAV serotype 2 (AAV2) infected human primary fibroblasts. Our findings indicate that the interferon-ɣ inducible factor 16 (IFI16) acts as an antiviral factor in AAV2 infection and AAV2 vector-mediated cell transduction in an immune-modulatory independent way by interrupting the Sp1-dependent gene expression from viral or vector genomes.

Abstract Adeno-associated virus type 2 (AAV2) is a small, non-pathogenic, helper virus-dependent parvovirus with a single-stranded (ss) DNA genome of approximately 4.7 kb. AAV2 DNA replication requires the presence of a helper virus such as adenovirus type 5 (AdV5) or herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and is generally assumed to occur as a strand-displacement rolling hairpin (RHR) mechanism initiated at the AAV2 3’ inverted terminal repeat (ITR). We have recently shown that AAV2 replication supported by HSV-1 leads to the formation of double-stranded head-to-tail concatemers, which provides evidence for a rolling circle replication (RCR) mechanism. We have revisited AAV2 DNA replication and specifically compared the formation of AAV2 replication intermediates in presence of either HSV-1 or AdV5 as the helper virus. The results confirmed that the AAV2 DNA replication mechanism is helper virus-dependent and follows a strand-displacement RHR mechanism when AdV5 is the helper virus and primarily an RCR mechanism when HSV-1 is the helper virus. We also demonstrate that recombination plays a negligible role in AAV2 genome replication. Interestingly, the formation of high molecular weight AAV2 DNA concatemers in presence of HSV-1 as the helper virus was dependent on an intact HSV-1 DNA polymerase. Importance AAV is a small helper virus-dependent, non-pathogenic parvovirus. The AAV genome replication mechanism was extensively studied in presence of AdV as the helper virus and described to proceed using RHR. Surprisingly, HSV-1 co-infection facilitates RCR of the AAV2 DNA. We directly compared AdV5 and HSV-1 supported AAV2 DNA replication and show that AAV2 can adapt its replication mechanism to the helper virus. Detailed understanding of the AAV replication mechanism expands our knowledge of virus biology and can contribute to increase gene therapy vector production.

Adeno-associated virus (AAV) serotypes infect a wide range of cell types, making this member of the parvovirus family a versatile tool in gene therapy. Infection as well as transduction is set in motion by means of specific receptors in conjunction with trafficking pathways, particularly endocytosis, a main cell entry pathway of non-enveloped viruses. Here, we report that efficacy of transduction is enhanced upon treating cells with hyperosmotic sucrose, a known blocker of clathrin-mediated endocytosis, through the non-canonical induction of autophagy. This mechanism of autophagy induction, however, is different from the previously reported AAV2-mediated induction of autophagy, which relies on a canonical, phosphoinositide 3-kinase class III (PI3K-III) complex-dependent pathway and appears to be dependent on the virus intrinsic secreted phospholipase A2 (sPLA 2 ) domain, particularly its catalytic center activity.

ABSTRACT Adeno-associated virus (AAV) genome replication only occurs in the presence of a co-infecting helper virus such as adenovirus type 5 (AdV5) or herpes simplex virus type 1 (HSV-1). AdV5-supported replication of the AAV genome has been described to occur in a strand-displacement rolling hairpin replication (RHR) mechanism initiated at the AAV 3’ inverted terminal repeat (ITR) end. It has been assumed that the same mechanism applies to HSV-1-supported AAV genome replication. Using nanopore sequencing as a novel, high-throughput approach to study viral genome replication we demonstrate the formation of double-stranded head-to-tail concatemers of AAV genomes in the presence of HSV-1, thus providing evidence for an unequivocal rolling circle replication (RCR) mechanism. This stands in contrast to the textbook model of AAV genome replication when HSV-1 is the helper virus. SIGNIFICANCE Efficient adeno-associated virus (AAV) replication requires the presence of helper factors, which can be provided by co-infecting helper viruses such as adenoviruses or herpesviruses. AAV replication has been described to occur as a rolling hairpin replication mechanism. However, we show that during a herpes simplex virus type 1 (HSV-1) supported replication, AAV rolling circle-like replication intermediates are formed. Thus, this study stands in contrast to the textbook model of AAV genome replication. Additionally, we introduce nanopore sequencing as a novel, high-throughput approach to study viral genome replication in unprecedented detail.

Abstract Nucleoli are membrane-less structures located within the nucleus and are known to be involved in many cellular functions, including stress response and cell cycle regulation. Besides, many viruses can employ the nucleolus or nucleolar proteins to promote different steps of their life cycle such as replication, transcription and assembly. While adeno-associated virus type 2 (AAV2) capsids have previously been reported to enter the host cell nucleus and accumulate in the nucleolus, both the role of the nucleolus in AAV2 infection, and the viral uncoating mechanism remain elusive. In all prior studies on AAV uncoating, viral capsids and viral genomes were not directly correlated on the single cell level, at least not in absence of a helper virus. To elucidate the properties of the nucleolus during AAV2 infection and to assess viral uncoating on a single cell level, we combined immunofluorescence analysis for detection of intact AAV2 capsids and capsid proteins with fluorescence in situ hybridization for detection of AAV2 genomes. The results of our experiments provide evidence that uncoating of AAV2 particles occurs in a stepwise process that is completed in the nucleolus and supported by alteration of the nucleolar structure. Author Summary Adeno-associated virus (AAV) capsids have been reported to enter the host cell nucleus and accumulate in the nucleolus. However, both the role of the nucleolus in AAV2 infection as well as the viral uncoating mechanism remain unknown. Here, we provide evidence that uncoating of the AAV2 particle is a stepwise process that is completed in the nucleolus and supported by alteration of the nucleolar morphology.

We determined the transcription profile of adeno-associated virus type 2 (AAV2)-infected primary human fibroblasts. Subsequent analysis revealed that cells respond to AAV infection through changes in several significantly affected pathways, including cell cycle regulation, chromatin modulation, and innate immune responses. Various assays were performed to validate selected differentially expressed genes and to confirm not only the quality but also the robustness of the raw data. One of the genes upregulated in AAV2-infected cells was interferon-γ inducible factor 16 (IFI16). IFI16 is known as a multifunctional cytosolic and nuclear innate immune sensor for double-stranded as well as single-stranded DNA, exerting its effects through various mechanisms, such as interferon response, epigenetic modifications, or transcriptional regulation. IFI16 thereby constitutes a restriction factor for many different viruses among them, as shown here, AAV2 and thereof derived vectors. Indeed, the post-transcriptional silencing of