Abstract Here we describe, the longest microbial time-series analyzed to date using high-resolution 16S rRNA tag pyrosequencing of samples taken monthly over 6 years at a temperate marine coastal site off Plymouth, UK. Data treatment effected the estimation of community richness over a 6-year period, whereby 8794 operational taxonomic units (OTUs) were identified using single-linkage preclustering and 21 130 OTUs were identified by denoising the data. The Alphaproteobacteria were the most abundant Class, and the most frequently recorded OTUs were members of the Rickettsiales (SAR 11) and Rhodobacteriales. This near-surface ocean bacterial community showed strong repeatable seasonal patterns, which were defined by winter peaks in diversity across all years. Environmental variables explained far more variation in seasonally predictable bacteria than did data on protists or metazoan biomass. Change in day length alone explains >65% of the variance in community diversity. The results suggested that seasonal changes in environmental variables are more important than trophic interactions. Interestingly, microbial association network analysis showed that correlations in abundance were stronger within bacterial taxa rather than between bacteria and eukaryotes, or between bacteria and environmental variables.

Microbes drive most ecosystems and are modulated by viruses that impact their lifespan, gene flow, and metabolic outputs. However, ecosystem-level impacts of viral community diversity remain difficult to assess due to classification issues and few reference genomes. Here, we establish an ∼12-fold expanded global ocean DNA virome dataset of 195,728 viral populations, now including the Arctic Ocean, and validate that these populations form discrete genotypic clusters. Meta-community analyses revealed five ecological zones throughout the global ocean, including two distinct Arctic regions. Across the zones, local and global patterns and drivers in viral community diversity were established for both macrodiversity (inter-population diversity) and microdiversity (intra-population genetic variation). These patterns sometimes, but not always, paralleled those from macro-organisms and revealed temperate and tropical surface waters and the Arctic as biodiversity hotspots and mechanistic hypotheses to explain them. Such further understanding of ocean viruses is critical for broader inclusion in ecosystem models.

This paper presents standards and best practices for reporting genome sequences of uncultivated viruses. We present an extension of the Minimum Information about any (x) Sequence (MIxS) standard for reporting sequences of uncultivated virus genomes. Minimum Information about an Uncultivated Virus Genome (MIUViG) standards were developed within the Genomic Standards Consortium framework and include virus origin, genome quality, genome annotation, taxonomic classification, biogeographic distribution and in silico host prediction. Community-wide adoption of MIUViG standards, which complement the Minimum Information about a Single Amplified Genome (MISAG) and Metagenome-Assembled Genome (MIMAG) standards for uncultivated bacteria and archaea, will improve the reporting of uncultivated virus genomes in public databases. In turn, this should enable more robust comparative studies and a systematic exploration of the global virosphere.

Abstract Marine viruses impact global biogeochemical cycles via their influence on host community structure and function, yet our understanding of viral ecology is constrained by limitations in culturing of important hosts and the lack of a ‘universal’ gene to facilitate community surveys. Short-read viral metagenomic studies have provided clues to viral function and first estimates of global viral gene abundance and distribution. However, short-read assemblies are confounded by populations with high levels of strain evenness and nucleotide diversity (microdiversity), limiting assembly of some of the most abundant viruses on Earth. Assembly across genomic islands which likely contain niche-defining genes that drive ecological speciation is also challenging. While such populations and features are successfully captured by single-virus genomics and fosmid-based approaches, both techniques require considerable cost and technical expertise. Here we established a low-cost, low-input, high throughput alternative method for improving assembly of viral metagenomics using long read technology. Named ‘VirION’ (Viral, long-read metagenomics via MinION sequencing), our sequencing approach and complementary bioinformatics pipeline (i) increased number and completeness of assembled viral genomes compared to short-read sequencing methods; (ii) captured populations of abundant viruses with high microdiversity missed by short-read methods and (iii) captured more and longer genomic islands than short-read methods. Thus, VirION provides a high throughput and cost-effective alternative to fosmid and single-virus genomic approaches to more comprehensively explore viral communities in nature.

Abstract Background Microbes and their viruses are hidden engines driving Earth’s ecosystems from the oceans and soils to humans and bioreactors. Though gene marker approaches can now be complemented by genome-resolved studies of inter- ( macro diversity) and intra- ( micro diversity) population variation, analytical tools to do so remain scattered or under-developed. Results Here we introduce MetaPop, an open-source bioinformatic pipeline that provides a single interface to analyze and visualize microbial and viral community metagenomes at both the macro - and micro -diversity levels. Macro diversity estimates include population abundances and α- and β-diversity. Micro diversity calculations include identification of single nucleotide polymorphisms, novel codon-constrained linkage of SNPs, nucleotide diversity (π and θ) and selective pressures (pN/pS and Tajima’s D) within and fixation indices (F ST ) between populations. MetaPop will also identify genes with distinct codon usage. Following rigorous validation, we applied MetaPop to the gut viromes of autistic children that underwent fecal microbiota transfers and their neurotypical peers. The macro diversity results confirmed our prior findings for viral populations (microbial shotgun metagenomes were not available), that diversity did not significantly differ between autistic and neurotypical children. However, by also quantifying micro diversity, MetaPop revealed lower average viral nucleotide diversity (π) in autistic children. Analysis of the percentage of genomes detected under positive selection was also lower among autistic children, suggesting that higher viral π in neurotypical children may be beneficial because it allows populations to better ‘bet hedge’ in changing environments. Further, comparisons of micro diversity pre- and post-FMT in the autistic children revealed that the delivery FMT method (oral versus rectal) may influence viral activity and engraftment of microdiverse viral populations, with children who received their FMT rectally having higher microdiversity post-FMT. Overall, these results show that analyses at the macro-level alone can miss important biological differences. Conclusions These findings suggest that standardized population and genetic variation analyses will be invaluable for maximizing biological inference, and MetaPop provides a convenient tools package to explore the dual impact of macro - and micro -diversity across microbial communities.

ABSTRACT Microbes play fundamental roles in shaping natural ecosystem properties and functions, but do so under constraints imposed by their viral predators. However, studying viruses in nature can be challenging due to low biomass and the lack of universal gene markers. Though metagenomic short-read sequencing has greatly improved our virus ecology toolkit— and revealed many critical ecosystem roles for viruses — microdiverse populations and fine-scale genomic traits are missed. Some of these microdiverse populations are abundant and the missed regions may be of interest for identifying selection pressures that underpin evolutionary constraints associated with hosts and environments. Though long-read sequencing promises complete virus genomes on single reads, it currently suffers from high DNA requirements and sequencing errors that limit accurate gene prediction. Here we introduce VirION2, an integrated short- and long-read metagenomic wet-lab and informatics pipeline that updates our previous method (VirION) to further enhance the utility of long-read viral metagenomics. Using a viral mock community, we first optimized laboratory protocols (polymerase choice, DNA shearing size, PCR cycling) to enable 76% longer reads (now median length of 6,965 bp) from 100-fold less input DNA (now 1 nanogram). Using a virome from a natural seawater sample, we compared viromes generated with VirION2 against other library preparation options (unamplified, original VirION, and short-read), and optimized downstream informatics for improved long-read error correction and assembly. VirION2 assemblies combined with short-read based data (‘enhanced’viromes), provided significant improvements over VirION libraries in the recovery of longer and more complete viral genomes, and our optimized error-correction strategy using long- and short-read data achieved 99.97% accuracy. In the seawater virome, VirION2 assemblies captured 5,161 viral populations (including all of the virus populations observed in the other assemblies), 30% of which were uniquely assembled through inclusion of long-reads, and 22% of the top 10% most abundant virus populations derived from assembly of long-reads. Viral populations unique to VirION2 assemblies had significantly higher microdiversity, which may explain why short-read virome approaches failed to capture them. These findings suggest the VirION2 sample prep and workflow (updated at protocols.io) can help researchers better investigate the virosphere, even from challenging low-biomass samples. Our new protocols are available to the research community on protocols.io as a ‘living document’ to facilitate dissemination of updates to keep pace with the rapid evolution of long read sequencing technology. Taken together, the addition of long-reads uniquely enabled the recovery of 22% of the most abundant viruses—that would have been missed in short-read only assemblies.

Abstract Microbes and their associated viruses are key drivers of biogeochemical processes in marine and soil biomes. While viruses of phototrophic cyanobacteria are well-represented in model systems, challenges of isolating marine microbial heterotrophs and their viruses have hampered experimental approaches to quantify the importance of viruses in nutrient recycling. A resurgence in cultivation efforts has improved the availability of fastidious bacteria for hypothesis testing, but this has not been matched by similar efforts to cultivate their associated bacteriophages. Here, we describe a high-throughput method for isolating important virus-host systems for fastidious heterotrophic bacteria that couples advances in culturing of hosts with sequential enrichment and isolation of associated phages. Applied to six monthly samples from the Western English Channel, we first isolated one new member of the globally dominant bacterial SAR11 clade and three new members of the methylotrophic bacterial clade OM43. We used these as bait to isolate 117 new phages including the first known siphophage infecting SAR11, and the first isolated phage for OM43. Genomic analyses of 13 novel viruses revealed representatives of three new viral genera, and infection assays showed that the viruses infecting SAR11 have ecotype-specific host-ranges. Similar to the abundant human-associated phage ΦCrAss001, infection dynamics within the majority of isolates suggested either prevalent lysogeny or chronic infection, despite a lack of associated genes; or host phenotypic bistability with lysis putatively maintained within a susceptible subpopulation. Broader representation of important virus-host systems in culture collections and genomic databases will improve both our understanding of virus-host interactions, and accuracy of computational approaches to evaluate ecological patterns from metagenomic data.

ABSTRACT The methylotrophic OM43 clade are Gammaproteobacteria that comprise some of the smallest free-living cells known and have highly streamlined genomes. OM43 represents an important microbial link 0between marine primary production and remineralisation of carbon back to the atmosphere. Bacteriophages shape microbial communities and are major drivers of microbial mortality and global marine biogeochemistry. Recent cultivation efforts have brought the first viruses infecting members of the OM43 clade into culture. Here we characterize a novel myophage infecting OM43 called Melnitz. Melnitz was isolated independently on three separate occasions (with isolates sharing >99.95% average nucleotide identity) from water samples from a subtropical ocean gyre (Sargasso Sea) and temperate coastal (Western English Channel) systems. Metagenomic recruitment from global ocean viromes confirmed that Melnitz is globally ubiquitous, congruent with patterns of host abundance. Bacteria with streamlined genomes such as OM43 and the globally dominant SAR11 clade use riboswitches as an efficient method to regulate metabolism. Melnitz encodes a two-piece tmRNA ( ssrA ), controlled by a glutamine riboswitch, providing evidence that riboswitch use also occurs for regulation during phage infection of streamlined heterotrophs. Virally encoded tRNAs and ssrA found in Melnitz were phylogenetically more closely related to those found within the alphaproteobacterial SAR11 clade and their associated myophages than those within their gammaproteobacterial hosts. This suggests the possibility of an ancestral inter-class host transition event between SAR11 and OM43. Melnitz and a related myophage that infects SAR11 were unable to infect hosts of the SAR11 and OM43, respectively, suggesting host transition rather than a broadening of host range. IMPORTANCE Isolation and cultivation of viruses is the foundation on which the mechanistic understanding of virus-host interactions and ground-truthing is based. This study isolated and characterised the first myophage known to infect the OM43 clade, expanding our knowledge of this understudied group of microbes. The near-identical genomes of four strains of Melnitz isolated from different marine provinces and global abundance estimations from metagenomic data suggest that this viral population is globally ubiquitous. Genome analysis revealed several unusual features in Melnitz and related genomes recovered from viromes, such as a curli operon and virally encoded tmRNA controlled by a glutamine riboswitch, neither of which are found in the host. Further phylogenetic analysis of shared genes indicates that this group of viruses infecting the gammaproteobacterial OM43 shares a recent common ancestor with viruses infecting the abundant alphaproteobacterial SAR11 clade. Host ranges are affected by compatible cell surface receptors, successful circumvention of superinfection exclusion systems and the presence of required accessory proteins, which typically limits phages to singular narrow groups of closely related bacterial hosts. This study provides intriguing evidence that for streamlined heterotrophic bacteria, virus-host transitioning is not necessarily restricted to phylogenetically related hosts, but is a function of shared physical and biochemical properties of the cell.

Abstract Intensification of fish farming practices is being driven by the demand for increased food production to support a rapidly growing global human population, particularly in lower-middle income countries. Intensification of production, however, increases the risk of disease outbreaks and thus the likelihood for crop losses. The microbial communities that colonise the skin mucosal surface of fish are poorly understood, but are important in maintaining fish health and resistance against disease. This skin microbial community is susceptible to disruption through stressors associated with transport, handling and the environment of intensive practices, and this risks the propagation of disease-causing pathogens. In this study, we characterised the microbial assemblages found on tilapia skin — the most widely farmed finfish globally — and in the surrounding water of seven earthen aquaculture ponds from two pond systems in distinct geographic regions in Malawi. Metabarcoding approaches were used to sequence the prokaryotic and microeukaryotic communities. We found 92% of prokaryotic amplicon sequence variants were common to both skin and water samples. Differentially enriched and core taxa, however, differed between the skin and water samples. In tilapia skin, Cetobacterium, Paucibacter, Pseudomonas and Comamonadaceae were enriched, whereas, the cyanobacteria Cyanobium, Microcystis and/or Synechocystis , and the diatom Cyclotella , were most prevalent in pond water. Ponds that clustered together according to their water prokaryotic communities also had similar microeukaryotic communities indicating strong environmental influences on prokaryotic and microeukaryotic community structures. While strong site-specific clustering was observed in pond water, the grouping of tilapia skin prokaryotes by pond site was less distinct, suggesting fish microbiota have a greater buffering capacity against environmental influences. The characterised diversity, structure and variance of microbial communities associated with tilapia culture in Malawi provide the baseline for studies on how future intensification practices may lead to microbial dysbiosis and disease onset. Highlights Fish skin and pond water communities differ structurally, but share common taxa Pond locations have a stronger influence on water versus fish skin microbiome community structure Selected skin-associated taxa could be used to monitor dysbiotic events in aquaculture Taxa with opportunistic pathogen potential were identified at low abundance