Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia bacteria are currently being released for arbovirus suppression around the world. Their potential to invade populations and persist will depend on interactions with environmental conditions, particularly as larvae are often exposed to fluctuating and extreme temperatures in the field. We reared Ae. aegypti larvae infected with different types of Wolbachia (wMel, wAlbB and wMelPop-CLA) under diurnal cyclical temperatures. Rearing wMel and wMelPop-CLA-infected larvae at 26-37°C reduced the expression of cytoplasmic incompatibility, a reproductive manipulation induced by Wolbachia. We also observed a sharp reduction in the density of Wolbachia in adults. Furthermore, the wMel and wMelPop-CLA infections were not transmitted to the next generation when mosquitoes were exposed to 26-37°C across all life stages. In contrast, the wAlbB infection was maintained at a high density, exhibited complete cytoplasmic incompatibility, and was transmitted from mother to offspring with a high fidelity under this temperature cycle. These findings have implications for the potential success of Wolbachia interventions across different environments and highlight the importance of temperature control in rearing.

Summary Mosquito-borne diseases such as dengue, Zika and chikungunya remain a major cause of morbidity and mortality across tropical regions. Population replacement strategies involving the w Mel strain of Wolbachia are being used widely to control mosquito-borne diseases transmitted by Aedes aegypti . However, these strategies may be influenced by environmental temperature because w Mel is vulnerable to heat stress. w Mel infections in their native host Drosophila melanogaster are genetically diverse, but few transinfections of w Mel variants have been generated in Ae. aegypti mosquitoes. Here we successfully transferred a w Mel variant (termed w MelM) originating from a field-collected D. melanogaster population from Victoria, Australia into Ae. aegypti . The new w MelM variant (clade I) is genetically distinct from the original w Mel transinfection (clade III) generated over ten years ago, and there are no genomic differences between w MelM in its original and transinfected host. We compared w MelM with w Mel in its effects on host fitness, temperature tolerance, Wolbachia density, vector competence, cytoplasmic incompatibility and maternal transmission under heat stress in a controlled background. w MelM showed a higher heat tolerance than w Mel, with stronger cytoplasmic incompatibility and maternal transmission when eggs were exposed to heat stress, likely due to higher overall densities within the mosquito. Both w Mel variants had minimal host fitness costs, complete cytoplasmic incompatibility and maternal transmission, and dengue virus blocking under standard laboratory conditions. Our results highlight phenotypic differences between closely related Wolbachia variants. w MelM shows potential as an alternative strain to w Mel in dengue control programs in areas with strong seasonal temperature fluctuations.

Abstract Aedes aegypti mosquito eggs can remain quiescent for many months before hatching, allowing populations to persist through unfavorable conditions. Aedes aegypti infected with the Wolbachia strain w Mel have been released in tropical and subtropical regions for dengue control. w Mel reduces the viability of quiescent eggs, but this physiological cost might be expected to evolve in natural mosquito populations that frequently experience stressful conditions. We therefore compared the costs of w Mel infection for quiescent egg viability in field-derived and laboratory populations. Quiescent egg viability was highly variable in w Mel-infected populations, with greater costs of w Mel in field-derived populations. In contrast, there was little variation between matched field-derived and long-term laboratory populations lacking w Mel, suggesting that laboratory adaptation does not influence this trait and that differences are due to w Mel infection. Comparisons of populations collected a year apart show a decline in costs under laboratory rearing conditions involving a rapid turnover of mosquito generations; this pattern was consistent across populations despite their origin, suggesting adaptation of mosquitoes to the w Mel infection under laboratory conditions. Reciprocal crossing experiments confirm that differences in quiescent egg viability were mainly due to the genetic background and not Wolbachia alone. w Mel-infected mosquitoes hatching from long-term quiescent eggs showed partial loss of cytoplasmic incompatibility and female infertility, highlighting additional costs of long-term quiescence. Our study provides the first evidence for a shift in Wolbachia phenotypic effects following deliberate field release and establishment and it highlights interactions between Wolbachia infections and local adaptation. The unexpected changes in fitness costs observed here suggest potential tradeoffs with undescribed fitness benefits of the w Mel infection.

Abstract The arbovirus vector Aedes albopictus (Asian tiger mosquito) is common throughout the Indo-Pacific region, where most global dengue transmission occurs. We analysed population genomic data and tested for cryptic species in 160 Ae. albopictus sampled from 16 locations across this region. We found no evidence of cryptic Ae. albopictus but found multiple intraspecific COI haplotypes partitioned into groups representing three Asian lineages: East Asia, Southeast Asia and Indonesia. Papua New Guinea (PNG), Vanuatu and Christmas Island shared recent coancestry, and Indonesia and Timor-Leste were likely invaded from East Asia. We used a machine learning trained on morphologically sexed samples to classify sexes using multiple genetic features and then characterized the w AlbA and w AlbB Wolbachia infections in 664 other samples. The w AlbA and w AlbB infections as detected by qPCR showed markedly different patterns in the sexes. For females, most populations had a very high double infection incidence, with 67% being the lowest value (from Timor-Leste). For males, the incidence of double infections ranged from 100% (PNG) to 0% (Vanuatu). Only 6 females were infected solely by the w AlbA infection, while rare uninfected mosquitoes were found in both sexes. The w AlbA and w AlbB densities varied significantly among populations. For mosquitoes from Torres Strait and Vietnam, the w AlbB density was similar in single-infected and superinfected ( w AlbA and w AlbB) mosquitoes. There was a positive association between w AlbA and w AlbB infection densities in superinfected Ae. albopictus . Our findings provide no evidence of cryptic species of Ae. albopictus in the region and suggest site-specific factors influencing the incidence of Wolbachia infections and their densities. We also demonstrate the usefulness of SNPs as sex-specific mosquito markers. The results provide baseline data for the exploitation of Wolbachia -induced cytoplasmic incompatibility (CI) in dengue control.

ABSTRACT Myzus persicae , a serious sap-sucking pest of a large variety of host plants in agriculture, is traditionally controlled using chemical insecticides but there is interest in using biopesticides as restrictions are increasingly placed on the use of broad-spectrum pesticides. Here we show that in petri dish experiments high concentrations of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (strain PRRI 5336) lead to rapid mortality of M. persicae but at a low concentration (1 × 10 4 conidia mL −1 ) there is a hormetic effect where longevity and fecundity are enhanced. Hormetic effects persisted across a generation with reduced development times and increased fecundity in the offspring of M. persicae exposed to B. bassiana . Whole plant experiments point to a hormetic effect being detected in two out of three tested lines. The impact of these effects might also depend on whether M. persicae was transinfected with the endosymbiont Rickettsiella viridis , which decreases fecundity and survival compared to aphids lacking this endosymbiont. This fecundity cost was ameliorated in the generation following exposure to the entomopathogen. While B. bassiana is effective in controlling M. persicae especially at higher spore concentrations, utilization of this entomopathogen requires careful consideration of hormetic effects at lower spore concentrations, and further research to optimize its application for sustainable agriculture is recommended. AUTHOR SUMMARY Biopesticides such as Beauveria bassiana can be effective alternatives to chemical insecticides to control insect pests. We tested the efficacy of this biopesticide against the important agricultural pest aphid Myzus persicae in laboratory experiments. We also tested whether the potential biological control agent and endosymbiont Rickettsiella viridis could provide protection against mortality caused by B. bassiana . While high doses of B. bassiana caused rapid mortality in aphids, low doses enhanced aphid fecundity and survival. This enhancement persisted into the next generation, with shortened development times and increased fecundity regardless, even when high doses were used in the previous generation. The endosymbiont R. viridis did not provide clear protection against B. bassiana , in contrast to previous studies in other aphid species, but beneficial effects at low doses also occurred in this aphid line. We also observed hormesis on experiments on whole plants, but only for some aphid genotypes. To a lesser extent, we also observed beneficial effects of low doses of B. bassiana in experiments on whole plants, but only in some aphid genotypes. Fitness enhancement by biopesticides at low doses raises concerns for field applications but further research is required to understand its underlying mechanisms.

Abstract Background Wolbachia w Mel is the most used strain in mosquito rear and release strategies that aim to inhibit the transmission of arboviruses such as dengue, Zika, Chikungunya and yellow fever. However, the long-term establishment of w Mel in natural populations of the dengue mosquito Aedes aegypti raises concerns that interactions between Wolbachia w Mel and Ae. aegypti may lead to changes in the host genome, which could affect useful attributes of Wolbachia that allow it to invade and suppress disease transmission. Results We applied an evolve-and-resequence approach to study genome-wide genetic changes in Ae. aegypti from the Cairns region, Australia, where Wolbachia w Mel was first introduced more than 10 years ago. Mosquito samples were collected at three different time points in Gordonvale, Australia, covering the phase before (2010) and after (2013 and 2018) Wolbachia releases. An additional three locations where Wolbachia replacement happened at different times across the last decade were also sampled in 2018. We found that the genomes of mosquito populations mostly remained stable after Wolbachia release, with population differences tending to reflect the geographic location of the populations rather than Wolbachia infection status. However, outlier analysis suggests that Wolbachia may have had an influence on some genes related to immune response, development, recognition and behavior. Conclusions Aedes aegypti populations remained geographically distinct after Wolbachia releases in North Australia despite their Wolbachia infection status. At some specific genomic loci, we found signs of selection associated with Wolbachia , suggesting potential evolutionary impacts can happen in the future and further monitoring is warranted.

Abstract Many mosquito species live close to humans where females feed on human blood. While male mosquitoes do not feed on blood, it has long been recognized that males of some species can be attracted to human hosts. To investigate the frequency of male mosquito attraction to humans, we conducted a literature review and human-baited field trials, as well as laboratory experiments involving males and females of three common Aedes species. Our literature review indicated that male attraction to humans is limited to a small number of species, including Ae. aegypti and Ae. albopictus. In our human-baited field collections, only 4 out of 13 species captured included males. In laboratory experiments, we found that male Ae. notoscriptus and Ae. vigilax showed no attraction to humans, while male Ae. aegypti exhibited persistent attraction for up to 30 minutes. Both male and female Ae. aegypti displayed similar preferences for different human subjects, suggesting that male Ae. aegypti respond to similar cues as females. Additionally, we found that mosquito repellents applied to human skin effectively repelled male mosquitoes. These findings shed light on mosquito behaviour and have implications for mosquito control programs, particularly those involving the release or monitoring of the male mosquito population.

Abstract With Wolbachia -based arbovirus control programs being scaled and operationalised around the world, cost effective and reliable detection of Wolbachia in field samples and laboratory stocks is essential for quality control. Here we validate a modified loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for routine scoring of Wolbachia in mosquitoes from laboratory cultures and the field, applicable to any setting. We show that this assay is a rapid and robust method for highly sensitive and specific detection of w AlbB Wolbachia infection within Aedes aegypti under a variety of conditions. We test the quantitative nature of the assay by evaluating pooled mixtures of Wolbachia -infected and uninfected mosquitoes and show that it is capable of estimating infection frequencies, potentially circumventing the need to perform large-scale individual analysis for w AlbB infection status in the course of field monitoring. These results indicate that LAMP assays are useful for routine screening particularly under field conditions away from laboratory facilities. Importance Releases of mosquitoes infected with strains of Wolbachia bacteria are expanding around the world because this bacterium that lives inside cells provides an effective tool to suppress mosquito populations and the ability of mosquitoes to transmit viruses. The success of the release programs relies on rapid and effective means of detecting Wolbachia and scoring their frequencies in mosquitoes for quality control and for assessing the success of releases. Here we test a “LAMP” (Loop-mediated isothermal amplification) assay for robust detection of Wolbachia infections in laboratory and field mosquito populations. We show that the assay can detect the bacteria when present at a low density in samples, and with a high degree of reproducibility. The assay uses a simple protocol which requires minimal training. It can readily detect Wolbachia in mosquitoes obtained from traps that are routinely used in field surveys. The assay should be cost effective in a variety of settings.

Abstract The intracellular bacterium Wolbachia inhibits virus replication and is being harnessed around the world to fight mosquito-borne diseases through releases of mosquitoes carrying the symbiont. Wolbachia strains vary in their ability to invade mosquito populations and suppress viruses in part due to differences in their density within the insect and associated fitness costs. Using whole-genome sequencing, we demonstrate the existence of two variants in w AlbB, a Wolbachia strain being released in natural populations of Aedes aegypti mosquitoes. The two variants display striking differences in genome architecture and gene content. Differences in the presence/absence of 49 genes between variants include genes located in prophage regions and others potentially involved in controlling the symbiont’s density. Importantly, we show that these genetic differences correlate with variation in w AlbB density and its tolerance to heat stress, suggesting that different w AlbB variants may be better suited for field deployment depending on local environmental conditions. Finally, we found that the w AlbB genome remained stable following its introduction in a Malaysian mosquito population. Our results highlight the need for further genomic and phenotypic characterization of Wolbachia strains in order to inform ongoing Wolbachia -based programmes and improve the selection of optimal strains in future field interventions. Importance Dengue is a viral disease transmitted by Aedes mosquitoes that threatens around half of the world population. Recent advances in dengue control involve the introduction of Wolbachia bacterial symbionts with antiviral properties into mosquito populations which can lead to dramatic decreases in the incidence of the disease. In light of these promising results, there is a crucial need to better understand the factors affecting the success of such strategies, in particular the choice of Wolbachia strain for field releases and the potential for evolutionary changes. Here we characterized two variants of a Wolbachia strain used for dengue control that differ at the genomic level and in their ability to replicate within the mosquito. We also found no evidence for the evolution of the symbiont within the two years following its deployment in Malaysia. Our results have implications for current and future Wolbachia -based health interventions.

Abstract Aedes aegypti mosquitoes carrying self-spreading, virus-blocking Wolbachia bacteria are being deployed to suppress dengue transmission. However, there are challenges in applying this technology in extreme environments. We introduced two Wolbachia strains into Ae. aegypti from Saudi Arabia for a release program in the hot coastal city of Jeddah. Wolbachia reduced infection and dissemination of dengue virus (DENV2) in Saudi Arabian mosquitoes and showed complete maternal transmission and cytoplasmic incompatibility. Wolbachia reduced mosquito heat tolerance and egg viability, with the Wolbachia strains showing differential thermal stability. Wolbachia effects were similar across mosquito genetic backgrounds but we found evidence of local adaptation, with Saudi Arabian mosquitoes having lower egg viability but higher adult desiccation tolerance than Australian mosquitoes. Genetic background effects will influence Wolbachia invasion dynamics, reinforcing the need to use local genotypes for mosquito release programs, particularly in extreme environments like Jeddah. Our comprehensive characterization of Wolbachia strains provides a foundation for Wolbachia -based disease interventions in harsh climates.