Commander is a multi-protein complex that orchestrates endosomal recycling of diverse integral cargo proteins and in humans is required for normal skeletal, brain, kidney, and cardiovascular development. While the structure of this complex has recently been described, the central question of how cargo proteins are selected for entry into the Commander recycling pathway remains unclear. Here using recombinant protein reconstitution and in silico predictions we identify the evolutionary conserved mechanism through which the unstructured carboxy terminal tail of the integral protein adaptor sorting nexin-17 (SNX17) directly binds to the Retriever sub-complex of Commander. SNX17 adopts an auto-inhibited conformation where its carboxy terminal tail occupies the cargo binding groove. Competitive cargo binding overcomes this auto-inhibition, promoting SNX17 endosomal residency and the release of the carboxy tail for Retriever association. Using molecular cell biology and high-resolution microscopy, we establish the central importance of SNX17-Retriever association in the handover of integrin and lipoprotein receptor cargoes into pre-existing endosomal retrieval sub-domains for entry into the recycling pathway. In describing the principal mechanism of cargo entry into the Commander recycling pathway we provide key insight into the function and regulation of this evolutionary conserved sorting complex.

SUMMARY The Commander complex is required for endosomal recycling of diverse transmembrane cargos and is mutated in Ritscher-Schinzel syndrome. It comprises two subassemblies; Retriever composed of VPS35L, VPS26C and VPS29, and the CCC complex which contains ten subunits COMMD1-COMMD10 and two coiled-coil domain-containing (CCDC) proteins CCDC22 and CCDC93. Combining X-ray crystallography, electron cryomicroscopy and in silico predictions we have assembled a complete structural model of Commander. Retriever is distantly related to the endosomal Retromer complex but has unique features preventing the shared VPS29 subunit from interacting with Retromer-associated factors. The COMMD proteins form a distinctive hetero-decameric ring stabilised by extensive interactions with CCDC22 and CCDC93. These adopt a coiled-coil structure that connects the CCC and Retriever assemblies and recruits a sixteenth subunit, DENND10, to form the complete Commander complex. The structure allows mapping of disease-causing mutations and reveals the molecular features required for the function of this evolutionarily conserved trafficking machinery.

SUMMARY Munc18-interacting proteins (Mints) are multi-domain adaptors that regulate neuronal membrane trafficking, signalling and neurotransmission. Mint1 and Mint2 are highly expressed in the brain with overlapping roles in the regulation of synaptic vesicle fusion required for neurotransmitter release by interacting with the essential synaptic protein Munc18-1. Here, we have used AlphaFold2 to identify and then validate the mechanisms that underpin both the specific interactions of neuronal Mint proteins with Munc18-1 as well as their wider interactome. We find a short acidic α-helical motif (AHM) within Mint1 and Mint2 is necessary and sufficient for specific binding to Munc18-1 and binds a conserved surface on Munc18-1 domain3b. In Munc18-1/2 double knockout neurosecretory cells mutation of the Mint-binding site reduces the ability of Munc18-1 to rescue exocytosis, and although Munc18-1 can interact with Mint and Sx1a proteins simultaneously in vitro we find they have mutually reduced affinities, suggesting an allosteric coupling between the proteins. Using AlphaFold2 to then examine the entire cellular network of putative Mint interactors provides a structural model for their assembly with a variety of known and novel regulatory and cargo proteins including ARF3/ARF4 small GTPases, and the AP3 clathrin adaptor complex. Validation of Mint1 interaction with a new predicted binder TJAP1 provides experimental support that AlphaFold2 can correctly predict interactions across such large-scale datasets. Overall, our data provides insights into the diversity of interactions mediated by the Mint family and shows that Mints may help facilitate a key trigger point in SNARE complex assembly and vesicle fusion.