SUMMARY Self-assembly of macromolecules into higher-order symmetric structures is fundamental for the regulation of biological processes. Higher-order symmetric structure self-assembly by the gene expression machinery, such as bacterial DNA-dependent RNA polymerase (RNAP), has never been reported before. Here, we show that the stress-response σ B factor from the human pathogen, Mycobacterium tuberculosis , induces the RNAP holoenzyme oligomerization into a supramolecular complex composed of eight RNAP units. Cryo-electron microscopy revealed a pseudo-symmetric structure of the RNAP octamer in which RNAP protomers are captured in an auto-inhibited state and display an open-clamp conformation. The structure shows that σ B is sequestered by the RNAP flap and clamp domains. The transcriptional activator RbpA prevented octamer formation by promoting the initiation-competent RNAP conformation. Our results revealed that nonconserved region of σ is an allosteric controller of transcription initiation and demonstrated how basal transcription factors can regulate gene expression by modulating the RNAP holoenzyme assembly and hibernation.

ABSTRACT The bacterial Rho factor is a ring-shaped motor triggering genome-wide transcription termination and R-loop dissociation. Rho is essential in many species, including in Mycobacterium tuberculosis where rho gene inactivation leads to rapid death. Yet, the M. tuberculosis Rho [ Mtb Rho] factor displays poor NTPase and helicase activities, and resistance to the natural Rho inhibitor bicyclomycin [BCM] that remain unexplained. Here, we address these unusual features by solving the cryo-EM structure of Mtb Rho at 3.3 Å resolution, providing a new framework for future antibiotic development. The Mtb Rho hexamer is poised into a pre-catalytic, open-ringed state wherein specific contacts stabilize ATP in intersubunit ATPase pockets, thereby explaining the cofactor preference of Mtb Rho. We reveal a leucine-to-methionine substitution that creates a steric bulk in BCM binding cavities near the positions of ATP γ-phosphates, and confers resistance to BCM at the expense of motor efficiency.

Cyanobacteria and evolutionarily related chloroplasts of algae and plants possess unique RNA polymerases (RNAPs) with characteristics that distinguish from canonical bacterial RNAPs. The largest subunit of cyanobacterial RNAP (cyRNAP) is divided into two polypeptides, β'1 and β'2, and contains the largest known lineage-specific insertion domain, Si3, located in the middle of the trigger loop and spans approximately half of the β'2 subunit. In this study, we present the X-ray crystal structure of Si3 and the cryo-EM structures of the cyRNAP transcription elongation complex plus the NusG factor with and without incoming nucleoside triphosphate (iNTP) bound at the active site. Si3 has a well-ordered and elongated shape that exceeds the length of the main body of cyRNAP, fits into cavities of cyRNAP and shields the binding site of secondary channel-binding proteins such as Gre and DksA. A small transition from the trigger loop to the trigger helix upon iNTP binding at the active site results in a large swing motion of Si3; however, this transition does not affect the catalytic activity of cyRNAP due to its minimal contact with cyRNAP, NusG or DNA. This study provides a structural framework for understanding the evolutionary significance of these features unique to cyRNAP and chloroplast RNAP and may provide insights into the molecular mechanism of transcription in specific environment of photosynthetic organisms.

Initiation of transcription requires the formation of the open promoter complex (RPo). For this, the sigma subunit of bacterial RNA polymerase (RNAP) binds to the non-template strand of the -10 element sequence of promoters and nucleates DNA unwinding. This is accompanied by a cascade of conformational changes on RNAP the mechanics of which remains elusive. Here, using single-molecule Forster resonance energy transfer and cryo-electron microscopy, we explored the conformational landscape of RNAP from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis upon binding to a single-stranded DNA fragment that includes the -10 element sequence (-10 ssDNA). We found that like the transcription activator RbpA, -10 ssDNA induced sigma subunit loading onto the DNA/RNA channels of RNAP. This triggered RNAP clamp closure and unswiveling that are required for RPo formation and RNA synthesis initiation. Our results reveal a mechanism of ssDNA-guided RNAP maturation and identify the sigma subunit as a regulator of RNAP conformational dynamics.

Abstract NusG is a transcription elongation factor that stimulates transcription pausing in Gram+ bacteria including Bacillus subtilis by sequence-specific interaction with a conserved pause-inducing -11 TTNTTT -6 motif found in the non-template DNA (ntDNA) strand within the transcription bubble. To reveal the structural basis of NusG-dependent pausing, we determined a cryo-EM structure of a paused transcription complex containing RNAP, NusG, and the TTNTTT motif in the ntDNA strand. Interaction of NusG with the ntDNA strand rearranges the transcription bubble by positioning three consecutive T residues in a cleft between NusG and the β-lobe domain of RNAP. We revealed that the RNAP swivel module rotation (swiveling), which widens (swiveled state) and narrows (non-swiveled state) a cleft between NusG and the β-lobe, is an intrinsic motion of RNAP and is directly linked to nucleotide binding at the active site and to trigger loop folding, an essential conformational change of all cellular RNAPs for the RNA synthesis reaction. We also determined cryo-EM structures of RNAP escaping from a paused transcription complex. These structures revealed the NusG-dependent pausing mechanism by which NusG-ntDNA interaction inhibits the transition from swiveled to non-swiveled states, thereby preventing trigger loop folding and RNA synthesis allosterically. This motion is also reduced by formation of an RNA hairpin within the RNA exit channel. Thus, the pause half-life can be modulated by the strength of the NusG-ntDNA interaction and/or the stability of the RNA hairpin. NusG residues that interact with the TTNTTT motif are widely conserved in bacteria, suggesting that NusG-dependent pausing of transcription is widespread. Significance statement Transcription pausing by RNA polymerase (RNAP) regulates gene expression where it controls co-transcriptional RNA folding, synchronizes transcription with translation, and provides time for binding of regulatory factors. Transcription elongation factor NusG stimulates pausing in Gram+ bacteria including Bacillus subtilis and Mycobacterium tuberculosis by sequence-specific interaction with a conserved pause motif found in the non-template DNA (ntDNA) strand within the transcription bubble. Our structural and biochemical results revealed that part of the conserved TTNTTT motif in ntDNA is extruded and sandwiched between NusG and RNAP. Our results further demonstrate that an essential global conformational change in RNAP is directly linked to RNA synthesis, and that the NusG-ntDNA interaction pauses RNA synthesis by interfering with this conformational change.