Cells respond to DNA double-strand breaks by recruiting factors such as the DNA-damage mediator protein MDC1, the p53-binding protein 1 (53BP1), and the breast cancer susceptibility protein BRCA1 to sites of damaged DNA. Here, we reveal that the ubiquitin ligase RNF8 mediates ubiquitin conjugation and 53BP1 and BRCA1 focal accumulation at sites of DNA lesions. Moreover, we establish that MDC1 recruits RNF8 through phosphodependent interactions between the RNF8 forkhead-associated domain and motifs in MDC1 that are phosphorylated by the DNA-damage activated protein kinase ataxia telangiectasia mutated (ATM). We also show that depletion of the E2 enzyme UBC13 impairs 53BP1 recruitment to sites of damage, which suggests that it cooperates with RNF8. Finally, we reveal that RNF8 promotes the G 2 /M DNA damage checkpoint and resistance to ionizing radiation. These results demonstrate how the DNA-damage response is orchestrated by ATM-dependent phosphorylation of MDC1 and RNF8-mediated ubiquitination.

Malignant progression in cancer requires populations of tumor-initiating cells (TICs) endowed with unlimited self renewal, survival under stress, and establishment of distant metastases. Additionally, the acquisition of invasive properties driven by epithelial-mesenchymal transition (EMT) is critical for the evolution of neoplastic cells into fully metastatic populations. Here, we characterize 2 human cellular models derived from prostate and bladder cancer cell lines to better understand the relationship between TIC and EMT programs in local invasiveness and distant metastasis. The model tumor subpopulations that expressed a strong epithelial gene program were enriched in highly metastatic TICs, while a second subpopulation with stable mesenchymal traits was impoverished in TICs. Constitutive overexpression of the transcription factor Snai1 in the epithelial/TIC-enriched populations engaged a mesenchymal gene program and suppressed their self renewal and metastatic phenotypes. Conversely, knockdown of EMT factors in the mesenchymal-like prostate cancer cell subpopulation caused a gain in epithelial features and properties of TICs. Both tumor cell subpopulations cooperated so that the nonmetastatic mesenchymal-like prostate cancer subpopulation enhanced the in vitro invasiveness of the metastatic epithelial subpopulation and, in vivo, promoted the escape of the latter from primary implantation sites and accelerated their metastatic colonization. Our models provide new insights into how dynamic interactions among epithelial, self-renewal, and mesenchymal gene programs determine the plasticity of epithelial TICs.

The development of specific antiviral therapies targeting SARS-CoV-2 remains fundamental because of the continued high incidence of COVID-19 and limited accessibility to antivirals in some countries. In this context, dark chemical matter (DCM), a set of drug-like compounds with outstanding selectivity profiles that have never shown bioactivity despite being extensively assayed, appears to be an excellent starting point for drug development. Accordingly, in this study, we performed a high-throughput screening to identify inhibitors of the SARS-CoV-2 main protease (Mpro) using DCM compounds as ligands. Multiple receptors and two different docking scoring functions were employed to identify the best molecular docking poses. The selected structures were subjected to extensive conventional and Gaussian accelerated molecular dynamics. From the results, four compounds with the best molecular behavior and binding energy were selected for experimental testing, one of which presented inhibitory activity with a Ki value of 48 ± 5 μM. Through virtual screening, we identified a significant starting point for drug development, shedding new light on DCM compounds.

Antiviral signaling, immune response and cell metabolism in human body are dysregulated by SARS-CoV-2, the causative agent of the COVID-19. Here, we show that SARS-CoV-2 accessory proteins ORF3a, ORF9b, ORF9c and ORF10 induce a significant mitochondrial and metabolic reprogramming in A549 lung epithelial cells. While all four ORFs caused mitochondrial fragmentation and altered mitochondrial function, only ORF3a and ORF9c induced a marked structural alteration in mitochondrial cristae. ORF9b, ORF9c and ORF10 induced largely overlapping transcriptomes. In contrast, ORF3a induced a distinct transcriptome, including the downregulation of numerous genes for proteins with critical mitochondrial functions and morphology. Genome-Scale Metabolic Models predicted common and private metabolic flux reprogramming, notably a depressed amino acid metabolism, and an enhanced metabolism of specific lipids distinctly induced by ORF3a. These findings reveal metabolic dependencies and vulnerabilities prompted by SARS-CoV-2 accessory proteins that may be exploited to identify new targets for intervention.

Abstract Viral accessory proteins play critical roles in viral escape form host innate immune responses and in viral inflammatory pathogenesis. Here we show that the SARS-CoV-2 accessory protein, ORF9b, but not other SARS-CoV-2 accessory proteins (ORF3a, ORF3b, ORF6, ORF7, ORF8, ORF9c, ORF10), strongly activates inflammasome-dependent caspase-1 in A549 lung carcinoma cells and THP-1 monocyte-macrophage cells. Exposure to lipopolysaccharide (LPS) and ATP additively enhanced the activation of caspase-1 by ORF9b, suggesting that ORF9b and LPS follow parallel pathways in the activation of the inflammasome and caspase-1. Following rational in silico approaches, we have designed small molecules capable of inhibiting the homodimerization of ORF9b, which experimentally inhibited ORF9b-ORF9b homotypic interactions, caused mitochondrial eviction of ORF9b, inhibited ORF9b-induced activation of caspase-1 in A549 and THP-1 cells, cytokine release in THP-1 cells, and restored type I interferon (IFN-I) signaling suppressed by ORF9b in both cell models. These small molecules are first-in-class compounds targeting a viral accessory protein critical for viral-induced exacerbated inflammation and escape from innate immune responses, with the potential of mitigating the severe immunopathogenic damage induced by highly pathogenic coronaviruses and restoring antiviral innate immune responses curtailed by viral infection.

Summary Several mechanisms of resistance of cancer cells to cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKi) have been identified, including the upregulation of metabolic regulators such as glutaminase. However, whether such mechanisms and targets are optimal has not been determined. Here, we have systematically analyzed metabolic reprogramming in colorectal cancer cells exposed to Palbociclib, a CDKi selectively targeting CDK4/6, or Telaglenestat, a selective glutaminase inhibitor. Through multiple approaches, we show that Palbociclib and Telaglenestat elicit complementary metabolic responses and are thus uniquely suited to counter the metabolic reprogramming induced by the reciprocal drug. As such, while Palbociclib induced reduced tumor growth in vivo , and Telaglenestat did not show a significant effect, the drug combination displayed a strong synergistic effect on tumor growth. Likewise, initial responses to Palbociclib were followed by signs of adaptation and resistance, which were prevented by combining Palbociclib with Telaglenestat. In conclusion, combination with Telaglenestat optimally forestalls acquired resistance to Palbociclib in cancer cells.

Abstract Compelling evidence has accumulated for the role of oxidative stress on the endothelial cell (EC) dysfunction underlying acute coronary syndromes. However, understanding the metabolic determinants of EC dysfunction has been hampered by the scarcity of appropriate cell models. Here, we have generated and phenotypically characterized EC derived from thrombectomy specimens in patients with acute myocardial infarction (AMI). We have found that AMI-derived endothelial cells (AMIECs), but not control EC from health coronary arteries, display impaired growth, migration and tubulogenesis. These phenotypic abnormalities were accompanied with metabolic abnormalities including augmentation of reactive oxygen species (ROS) and glutathione intracellular content, along with diminished glucose consumption coupled to increased lactate production. In AMIECs, the protein levels of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase type 3, PFKFB3, were downregulated, while those of PFKFB4 were upregulated, suggesting a shunting of glycolysis towards the pentose phosphate pathway (PPP) in the pathological ECs. PPP overactivation was further supported by upregulation of G6PD in AMIECs, the key enzyme in the oxidative branch of the PPP, which supplies the bulk of NADPH reducing equivalents necessary for the reduction/turnover and lipid synthesis.. Further, the glutaminolytic enzyme glutaminase (GLS) was upregulated in AMIECs, providing a mechanistic explanation for the observed increase in glutathione content. Finally, AMIECs had higher mitochondrial membrane potential than control ECs, which, together with high ROS levels, suggest a highly coupled mitochondrial activity in patient ECs. We suggest that high proton coupling underlies the abnormally high production of ROS, balanced by PPP-driven glutathione turnover, as a primary, cell-autonomous abnormality driving EC dysfunction in AMI.