Abstract Cardiac troponin C (cTnC) is the Ca 2+ -sensing component of the thin filament. It contains structural sites (III/IV) which bind both Ca 2+ and Mg 2+ , and a regulatory site (II) that has been thought to bind only Ca 2+ . The latter binding initiates a series of conformational changes that culminate in force production. We have quantified the interaction between site II and Ca 2+ /Mg 2+ through Isothermal Titration Calorimetry and Thermodynamic Integration simulations. Direct and competitive binding titrations using wild type and a double mutant that significantly reduces binding to site II demonstrated that physiologically relevant concentrations of both Ca 2+ /Mg 2+ interact with the same locus. Cytosolic free Mg 2+ (~1 mM) could occupy a significant population of available site II, as this concentration of Mg 2+ decreased the affinity for Ca 2+ 1.4-fold. Interaction of Mg 2+ with site II of cTnC likely has important functional consequences for the heart at baseline and in diseased states which decrease or increase availability of Mg 2+ such as secondary hyperparathyroidism or ischemia, respectively.

Abstract Cardiac troponin C (cTnC) is the calcium (Ca 2+ ) sensing component of the troponin complex. Binding of Ca 2+ to cTnC triggers a cascade of myofilament conformational changes that culminate in force production. Mutations in cTnC linked to hypertrophic myocardial myopathy (HCM) induce a a greater degree and duration of Ca 2+ binding, which may underly the hypertrophic phenotype. Recent evidence from our laboratories demonstrated novel modifications of cTnC Ca 2+ binding by cellular magnesium (Mg 2+ ) that we hypothesize may be of significance in promoting HCM. Regulation of contraction has long been thought to occur exclusively through Ca 2+ binding to site II of cTnC. However, abundant cellular Mg 2+ is a potential competitor for binding to the same sites; work by several groups also suggests this is possible. We have used isothermal titration calorimetry (ITC) to explore the thermodynamic properties associated with the interaction between Ca 2+ /Mg 2+ and site II of cTnC; these experiments demonstrated that physiological concentrations of Mg 2+ may compete with Ca 2+ to bind site II of cTnC. In experiments reported here, we studied a series of mutations in cTnC thought to be causal in HCM. Three mutants (A8V, L29Q, and A31S) slightly elevated the affinity for both Ca 2+ and Mg 2+ , whereas other mutants (L48Q, Q50R, and C84Y), that are closer to the C-terminal domain and surrounding the EF hand binding motif of site II had a more significant effect on affinity and the thermodynamics of the binding interaction. To the best of our knowledge, this work is the first to explore the role of Mg 2+ in modifying the Ca 2+ affinity ofcTnC mutations linked to HCM. Our results indicate a physiologically significant role for cellular Mg 2+ at baseline conditions and when elevated on the control of the dynamics of contraction by modifications in the Ca 2+ binding properties of cTnC.

Abstract Hyperactivity of cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) ryanodine receptor (RyR2) Ca 2+ -release channels contributes to heart failure and arrhythmias. Reducing RyR2 activity, particularly during cardiac relaxation (diastole), is a desirable therapeutic goal. We previously reported that the unnatural enantiomer ( ent ) of an insect-RyR activator, verticilide, inhibits porcine and mouse RyR2 at diastolic (nanomolar) Ca 2+ and has in vivo efficacy against atrial and ventricular arrhythmia. To determine the ent -verticilide structural mode of action on RyR2 and guide its further development via medicinal chemistry structure-activity relationship studies, here we used fluorescence lifetime (FLT)-measurements of Förster resonance energy transfer (FRET) in HEK293 cells expressing human RyR2. For these studies, we used an RyR-specific FRET molecular-toolkit and computational methods for trilateration (i.e., using distances to locate a point of interest). Multi-exponential analysis of FLT-FRET measurements between four donor-labeled FKBP12.6 variants and acceptor-labeled ent -verticilide, yielded distance relationships placing the acceptor probe at two candidate loci within the RyR2 cryo-EM map. One locus is within the Ry12 domain (at the corner periphery of the RyR2 tetrameric complex). The other locus is sandwiched at the interface between helical domain 1 and the SPRY3 domain. These findings document RyR2-target engagement by ent -verticilide, reveal new insight into the mechanism of action of this new class of RyR2-targeting drug candidate, and can serve as input in future computational determinations of the ent -verticilide binding site on RyR2 that will inform structure-activity studies for lead optimization.

As the primary Ca

Abstract Several mutations identified in phospholamban (PLN) have been linked to familial dilated cardiomyopathy (DCM) and heart failure, yet the underlying molecular mechanism remains controversial. PLN interacts with sarco/endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase (SERCA) and regulates calcium uptake, which is modulated by the protein kinase A (PKA)-dependent phosphorylation of PLN during the fight-or-flight response. Here, we present the crystal structures of the catalytic domain of PKA in complex with wild-type and DCM-mutant PLNs. Our structures, combined with the results from other biophysical and biochemical assays, reveal a common disease mechanism: the mutations in PLN reduce its phosphorylation level by changing its conformation and weakening its interactions with PKA. In addition, we demonstrate that another more ubiquitous SERCA-regulatory peptide, called another-regulin (ALN), shares a similar mechanism mediated by PKA in regulating SERCA activity. Significance Dilated cardiomyopathy (DCM) is a common type of heart disease. Familial DCM is associated with mutations on phospholamban (PLN), but the mechanism remains elusive. Phosphorylation of PLN is known to influence its physiological function. We hypothesize that the connection between such mutations and DCM may involve decreased PLN phosphorylation levels due to less efficient binding to protein kinase A. We utilize x-ray crystallography, SPR, enzyme kinetic assays, thermal melt assays, and NMR to examine the structural and energetic consequences for PKA-catalyzed phosphorylation of PLN variants containing DCM-associated mutations. Our results provide a foundation to understand the general working mechanism of PKA and the physiological regulation of PLN by PKA, and also provide important insight into the pathological mechanism of DCM.

Abstract β-adrenergic signalling leads to activation of cAMP-dependent protein kinase (PKA), which can regulate the activity of L-type voltage-gated calcium channels (Ca V s) in multiple tissues. In Ca V 1.2, various sites have been proposed to be involved, including Ser1981 in the C-terminal tail. Its phosphorylation is linked to diabetes progression, synaptic plasticity, and the augmentation of Ca 2+ currents in smooth muscle. Its role in augmenting cardiac Ca 2+ currents has been heavily scrutinized, with alternative models including the sites Ser1718 and Ser1535. Recently, the GTPase Rad has been identified as a critical PKA target that mediates the augmentation of cardiac Ca V 1.2 currents upon its phosphorylation. However, it is unclear which of the four potential sites (Ser25, Ser38, Ser272, and Ser300) are favored by PKA. Using quantitative binding experiments and enzyme kinetics, we show that there are two Tiers of target sites, with Ca V 1.2 residue Ser1981 and Rad residues Ser25 and Ser272 forming Tier 1 substrates for PKA. The other sites form a second Tier, with PKA only showing minimal detectable activity. The Tier 1 substrates share a common feature with two arginine residues that anchor the peptide into the active site of PKA. We report crystal structures of the PKA catalytic subunit (PKAc) with and without a Ca V 1.2 substrate that represent different successive conformations prior to product turnover. Different target sites utilize different anchoring residues, highlighting the plasticity of PKAc to recognize substrates. Summary Stress signals can alter the electrical properties of excitable cells. cAMP-dependent protein kinase A (PKA) is a key enzyme that is activated upon β-adrenergic stimulation and can alter the function of L-type voltage-gated calcium channels (Ca V s) in various tissues. There is a lot of controversy surrounding the exact recognition and specificity of PKA towards Ca V 1.2, a key calcium channel located in neuronal, cardiac, and smooth muscle tissue, among others. Using a quantitative and unbiased approach, we determined the substrate specificities of PKA towards various sites in Ca V 1.2 and Rad, an inhibitory protein. Our work highlights two Tiers of substrates, suggesting a potential graded response. Using X-ray crystallography, we determined a high-resolution structure of PKA bound to its strongest target site in Ca V 1.2, showing how PKA undergoes multiple structural transitions towards binding and how it makes use of a unique anchoring residue.

Abstract For structures determined by single particle cryo-EM, no technique currently exists for mapping elements to defined locations, leading to errors in the assignment of metals and other ions, cofactors, substrates, inhibitors, and lipids that play essential roles in activity and regulation. Elemental mapping in the electron microscope is well established for dose-tolerant samples but is challenging for biological samples, especially in a cryo-preserved state. Here, we combine electron energy-loss spectroscopy (EELS) with single-particle image processing to allow elemental mapping in cryo-preserved macromolecular complexes. Proof-of-principle data show that our method, REEL-EM, allows 3D reconstruction of EELS data, such that a high total electron dose is accumulated across many copies of a complex. Working with two test samples, we demonstrate that we can reliably localise abundant elements. We discuss the current limitations of the method and potential future developments.