Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is a recently identified coronavirus that causes the respiratory disease known as coronavirus disease 2019 (COVID-19). Despite the urgent need, we still do not fully understand the molecular basis of SARS-CoV-2 pathogenesis. Here, we comprehensively define the interactions between SARS-CoV-2 proteins and human RNAs. NSP16 binds to the mRNA recognition domains of the U1 and U2 splicing RNAs and acts to suppress global mRNA splicing upon SARS-CoV-2 infection. NSP1 binds to 18S ribosomal RNA in the mRNA entry channel of the ribosome and leads to global inhibition of mRNA translation upon infection. Finally, NSP8 and NSP9 bind to the 7SL RNA in the signal recognition particle and interfere with protein trafficking to the cell membrane upon infection. Disruption of each of these essential cellular functions acts to suppress the interferon response to viral infection. Our results uncover a multipronged strategy utilized by SARS-CoV-2 to antagonize essential cellular processes to suppress host defenses.

ABSTRACT Objective Coagulopathy in severe COVID-19 is common but poorly understood. The purpose of this study was to determine how SARS-CoV-2 infection impacts histone levels, fibrin structure, and endogenous thrombin potential in the presence and absence of endothelial cells. Approach We studied individuals with SARS-CoV-2 infection and acute respiratory distress syndrome at the time of initiation of mechanical ventilation compared to healthy controls. Blood samples were assayed for levels of histone-DNA complexes. Confocal microscopy was used to evaluate fibrin structure in clots formed from recalcified plasma samples using fluorescently-labeled fibrinogen. Endogenous thrombin potential was measured by calibrated automated thrombin assays in the presence of tissue factor and phospholipid (PCPS) or cultured human endothelial cells. Results Circulating nucleosomes were elevated in the plasma of COVID-19 patients relative to healthy controls (n=6, each group). COVID-19 patient plasma thrombin generation was also altered. Despite having an increased endogenous thrombin potential, patient plasma samples exhibited prolonged lag times and times to peak thrombin in the presence of added tissue factor and PCPS. Strikingly different results were observed when endothelial cells were used in place of tissue factor and PCPS. Control plasma samples did not generate measurable thrombin (lag time >60 min); in contrast, plasma samples from COVID-19+ patients generated thrombin (mean lag time ∼20 min). Consistent with the observed alterations in thrombin generation, clots from COVID-19 subjects exhibited a denser fibrin network, thinner fibers and lower fibrin resolvability. Conclusions Elevated histones, aberrant fibrin formation, and increased endothelial-dependent thrombin generation in COVID-19 may contribute to coagulopathy. HIGHLIGHTS Histone-DNA complexes are significantly elevated in the plasma of patients with severe SARS-CoV-2 infection. Measures of thrombin generation by calibrated automated thrombography and fibrin clots formed in situ are altered in severe COVID-19. Plasma from COVID-19 patients promotes thrombin generation on cultured endothelial cells in the absence of added tissue factor or phospholipids. The additive effects of histones on thrombin generation and endothelial cell function may play a major role in the thrombotic complications observed in severe SARS-CoV-2 infection.

Intron retention (IR) occurs in the transcripts of certain genes involved in the inflammatory response. IR decreases the amount of mRNA that can be produced from a given amount of transcript and therefore reduces the protein output from the gene. IR occurs at one intron of the Irf7 gene, an important transcription factor for producing interferons. We have identified Bud13 as an RNA-binding protein that acts at this intron to increase the amount of successful splicing. Deficiency in Bud13 leads to increased IR, decreased mature Irf7 transcript and protein levels, and consequently to a dampened type I interferon response. Viral infection of Bud13-deficient cells revealed that the impairment of Irf7 production compromises their ability to withstand VSV infection. Global analysis of Bud13 knockdown and BUD13 cross-linking to RNA reveals that a subset of introns, with similar characteristics to the one found in Irf7 (short, GC-rich with poor splice donor sequences), are spliced in a Bud13-dependent manner, increasing mRNA production from these genes. Thus, by acting as an antagonist to IR, Bud13 upregulates the expression of genes at which IR occurs.

During thymic development, most γδ T cells acquire innate-like characteristics that are critical for their function in tumor surveillance, infectious disease, and tissue repair. The mechanisms, however, that regulate γδ T cell developmental programming remain unclear. Recently, we demonstrated that the SLAM-SAP signaling pathway regulates the development and function of multiple innate-like γδ T cell subsets. Here, we used a single-cell proteogenomics approach to identify SAP-dependent developmental checkpoints and to define the SAP-dependent γδ TCR repertoire. SAP deficiency resulted in both a significant loss of an immature

Inflammation involves timed gene expression, suggesting that the fine-tuned onset, amplitude, and termination of expression of hundreds of genes is of critical importance to organismal homeostasis. Recent study of post-transcriptional regulation of inflammatory gene expression led to the suggestion of a regulatory role for pre-mRNA splicing. Here, using a hybrid capture approach to purify incompletely spliced, chromatin-associated pre-mRNAs, we use deep sequencing to study pre-mRNA splicing of the NF-kB transcriptome. By freezing transcription and examining subsequent splicing of complete transcripts, we find many introns splice tens to hundreds of times slower than average. In many cases, this is attributable to poor splice donor sequences that are evolutionarily conserved. When these introns were altered by ~2 base pairs to yield stronger splice donors, gene expression levels increased markedly for several genes in the context of a reporter system. We propose that such splice sites represent a regulatory mechanism that determines the timing of production of the mRNAs from certain inflammatory genes and may also limit mRNA expression from these genes. Further work will be needed to understand the roles of this regulation in the inflammatory response. The suggestion of extensive temporal regulation of pre-mRNA splicing as a regulatory process in inflammation raises the question of where else in biology there may be timed processes with a similar underlying cause.