Formation of root hairs involves the targeted recruitment of the cellular growth machinery to the root hair initiation domain (RHID), a specialized site at the plasma membrane (PM) of trichoblast cells. Early determinants in RHID establishment are small GTPases of the Rho-of-plants (ROP) protein family, which are required for polarization of downstream effectors, membrane modification and targeted secretion during tip growth. It remains, however, not fully understood how ROP GTPases themselves are polarized. To investigate the mechanism underlying ROP2 recruitment, we employed Variable Angle Epifluorescence Microscopy (VAEM) and exploited mCitrine fluorophore blinking for single molecule localization, particle tracking and super-resolved imaging of the trichoblast plasma membrane. We observed the association of mCit-ROP2 within distinct membrane nanodomains, whose polar occurrence at the RHID was dependent on the presence of the RopGEF GEF3, and found a gradual, localized decrease of mCit-ROP2 protein mobility that preceded polarization. We provide evidence for a step-wise model of ROP2 polarization that involves (i) an initial non-polar recruitment to the plasma membrane via interactions with anionic phospholipids, (ii) ROP2 assembly into membrane nanodomains independent of nucleotide-binding state and, sub-sequently, (iii) lateral sorting into the RHID, driven by GEF3-mediated localized reduction of ROP2 mobility.

Root hairs are tubular protrusions of the root epidermis that significantly enlarge the exploitable soil volume in the rhizosphere. Trichoblasts, the cell type responsible for root hair formation, switch from cell elongation to tip growth through polarization of the growth machinery to a pre-defined root hair initiation domain (RHID) at the plasma membrane. The emergence of this polar domain resembles the establishment of cell polarity in other eukaryotic systems [[1][1]–[3][2]]. Rho-type GTPases of plants (ROPs) are among the first molecular determinants of the RHID [[4][3], [5][4]] and later play a central role in polar growth [[6][5]]. Numerous studies have elucidated mechanisms that position the RHID in the cell [[7][6]–[9][7]] or regulate ROP activity [[10][8]–[18][9]]. The molecular players that target ROPs to the RHID and initiate outgrowth, however, have not been identified. We dissected the timing of the growth machinery assembly in polarizing hair cells and found that positioning of molecular players and outgrowth are temporally separate processes that are each controlled by specific ROP guanine nucleotide exchange factor (GEFs). A functional analysis of trichoblast-specific GEFs revealed GEF3 to be required for normal ROP polarization and thus efficient root hair emergence, while GEF4 predominantly regulates subsequent tip growth. Ectopic expression of GEF3 induced the formation of spatially confined, ROP-recruiting domains in other cell types, demonstrating the role of GEF3 to serve as a membrane landmark during cell polarization. [1]: #ref-1 [2]: #ref-3 [3]: #ref-4 [4]: #ref-5 [5]: #ref-6 [6]: #ref-7 [7]: #ref-9 [8]: #ref-10 [9]: #ref-18

How plant cells re-establish differential growth to initiate organs is poorly understood. Morphogenesis of lateral roots relies on the tightly controlled radial expansion and asymmetric division of founder cells. The cellular mechanisms that license and ensure these features are unknown. Here, we quantitatively analyse F-actin and microtubule dynamics during LR initiation. Using mutants, pharmacological and tissue-specific genetic perturbations, we show that dynamic reorganisation of both microtubule and F-actin networks is required for the asymmetric expansion of the founder cells. This cytoskeleton remodelling intertwine with auxin signalling in the pericycle and endodermis in order for founder cells to acquire a basic polarity required for initiating LR development. Our results reveal the conservation of cell remodelling and polarisation strategies between the Arabidopsis zygote and lateral root founder cells. We propose that coordinated, auxin-driven reorganisation of the cytoskeleton licenses asymmetric cell growth and divisions during embryonic and post-embryonic organogenesis.

Abstract During plant fertilisation, excess male gametes compete for a limited number of female gametes. The dormant male gametophyte, encapsulated in the pollen grain, consists of two sperm cells enclosed in a vegetative cell. After reaching the stigma of a compatible flower, quick and efficient germination of the vegetative cell to a tip-growing pollen tube is crucial to ensure fertilisation success. RHO OF PLANTS (ROP) signalling and their activating ROP GUANINE NUCLEOTIDE EXCHANGE FACTORS (ROPGEFs) are essential for initiating polar growth processes in multiple cell types. However, which ROPGEFs activate pollen germination is unknown. We investigated the role of ROPGEFs in initiating pollen germination and the required cell polarity establishment. Of the five pollen-expressed ROPGEFs, we found that GEF8, GEF9, and GEF12 are required for pollen germination and male fertilisation success, as gef8;gef9;gef12 triple mutants showed almost complete loss of pollen germination in vitro and had a reduced allele transmission rate. Live cell imaging and spatiotemporal analysis of subcellular protein distribution showed that GEF8 and GEF9, but not GEF12, displayed transient polar protein accumulations at the future site of pollen germination minutes before pollen germination, demonstrating specific roles for GEF8 and GEF9 during the initiation of pollen germination. Furthermore, this novel GEF accumulation appears in a biphasic temporal manner and can shift its location. We showed that the C-terminal domain of GEF8 and GEF9 confers this protein accumulation and demonstrated that GEFs locally activate ROPs and alter Ca 2+ signalling, which is required for pollen tube germination. We demonstrated that GEFs do not act redundantly during pollen germination and described for the first time a polar domain with spatiotemporal flexibility, which is crucial for the de novo establishment of a polar growth domain within a cell and, thus, for pollen function and fertilisation success.

In flowering plants, successful reproduction relies on an exchange of signals between synergids and pollen tubes (PTs), mediating the invasion of a synergid by the PT, which then ruptures and releases two sperm cells to effect double fertilization. However, how exactly the PT invades the receptive synergid is unknown as the spatial relationship between these two cells is unclear. To better understand this process we performed 3D live imaging of PT reception in Arabidopsis thaliana. Upon arrival at the filiform apparatus (FA), a region rich in membrane folds at the micropylar pole of the synergids, the PT gradually deforms the FA before it rapidly grows into the receptive synergid. Upon penetration, the membrane of the receptive synergid invaginates and envelopes the PT. We termed this newly discovered structure the peri-tubular membrane (PRM). We show that, in feronia mutants disrupting PT reception, the PT still enters the receptive synergid, forming a normal PRM. This results in extensive invagination of the synergid membrane without sperm release. We show that PRM formation is associated with a cytosolic calcium ([Ca2+]cyt) spike of high amplitude in the PT and flooding of [Ca2+]cyt in the synergids. In PTs lacking AUTOINHIBITED Ca2+ ATPASE9 activity, PTs have lower amplitude [Ca2+]cyt spiking and the PTs frequently fail to penetrate the synergid. Our findings suggest that synergid penetration and the non-cell autonomous control of PT rupture are distinct regulated processes required for fertilization in flowering plants.