In animals, Hox transcription factors define regional identity in distinct anatomical domains. How Hox genes encode this specificity is a paradox, because different Hox proteins bind with high affinity in vitro to similar DNA sequences. Here, we demonstrate that the Hox protein Ultrabithorax (Ubx) in complex with its cofactor Extradenticle (Exd) bound specifically to clusters of very low affinity sites in enhancers of the shavenbaby gene of Drosophila. These low affinity sites conferred specificity for Ubx binding in vivo, but multiple clustered sites were required for robust expression when embryos developed in variable environments. Although most individual Ubx binding sites are not evolutionarily conserved, the overall enhancer architecture-clusters of low affinity binding sites-is maintained and required for enhancer function. Natural selection therefore works at the level of the enhancer, requiring a particular density of low affinity Ubx sites to confer both specific and robust expression.

Abstract Although the effects of genetic and environmental perturbations on multicellular organisms are rarely restricted to single phenotypic layers, our current understanding of how developmental programs react to these challenges remains limited. Here, we have examined the phenotypic consequences of disturbing the bicoid regulatory network in early Drosophila embryos. We generated flies with two extra copies of bicoid , which causes a posterior shift of the network’s regulatory outputs and a decrease in fitness. We subjected these flies to EMS mutagenesis, followed by experimental evolution. After only 8–15 generations, experimental populations have normalized patterns of gene expression and increased survival. Using a phenomics approach, we find that populations were normalized through rapid increases in embryo size driven by maternal changes in metabolism and ovariole development. We extend our results to additional populations of flies, demonstrating predictability. Together, our results necessitate a broader view of regulatory network evolution at the systems level.

Abstract How epigenetic modulators of gene regulation affect the development and evolution of animals has been difficult to ascertain. Despite the widespread presence of histone 3 lysine 4 monomethylation (H3K4me1) on enhancers, hypomethylation appears to have minor effects on animal development and viability. In this study, we performed quantitative, unbiased and multi-dimensional explorations of key phenotypes on Drosophila melanogaster with genetically induced hypomethylation. Hypomethylation reduced transcription factor enrichment in nuclear microenvironments, leading to reduced gene expression, and phenotypes outside of standard laboratory conditions. Our developmental phenomics survey further showed that H3K4me1 hypomethylation led to context-dependent changes in morphology, metabolism, and behavior. Therefore, H3K4me1 may contribute to phenotypic evolution as a phenotypic capacitor by buffering the effects of chance, genotypes and environmental conditions on transcriptional enhancers. Quote “Developmental biologists are often not so much opposed to a role for ecology as they simply ignore it” –Doug Erwin 1

Although the effects of genetic and environmental perturbations on multicellular organisms are rarely restricted to single phenotypic layers, our current understanding of how developmental programs react to these challenges at a systems level remains limited. Here, we have examined the phenotypic consequences of disturbing the classic bicoid network in Drosophila , which is essential for anterior-posterior patterning in the early embryo. This network can be synthetically perturbed by increasing the dosage of bicoid , which causes a posterior shift of the network's regulatory outputs and a decrease in fitness. To directly monitor network changes across populations and time with extra copies of bicoid , we performed genome-wide EMS mutagenesis, followed by experimental evolution. After only 8-15 generations, experimental populations have normalized patterns of gene expression and increased survival. Using a phenomics approach, we find that populations were normalized through rapid increases in embryo size driven by maternal changes in metabolism and ovariole development. We extend our results to additional populations of flies, demonstrating predictability. Together, our results necessitate a broader view of regulatory network evolution at the systems level. In the future, such synthetic evolution approaches using animal models could provide a generalizable platform for studying the propagation of genetic perturbations across the many layers of complex multicellular systems.

Abstract Rapid enhancer and slow promoter evolution have been demonstrated through comparative genomics. However, it is not clear how this information is encoded genetically and if this can be used to place evolution in a predictive context. Part of the challenge is that our understanding of the potential for regulatory evolution is biased primarily toward natural variation or limited experimental perturbations. Here, to explore the evolutionary capacity of promoter variation, we surveyed an unbiased mutation library for three promoters in Drosophila melanogaster . We found that mutations in promoters had limited to no effect on spatial patterns of gene expression. Compared to developmental enhancers, promoters are more robust to mutations and have more access to mutations that can increase gene expression, suggesting that their low activity might be a result of selection. Consistent with these observations, increasing the promoter activity at the endogenous locus of shavenbaby led to increased transcription yet limited phenotypic changes. Taken together, developmental promoters may encode robust transcriptional outputs allowing evolvability through the integration of diverse developmental enhancers. Quote “Regulators, mount up [at transcriptional promoters].” - Warren G & Nate Dogg, 1994

We had previously shown in Drosophila melanogaster embryos that low-affinity Ultrabithorax (Ubx)-responsive shavenbaby (svb) enhancers drive robust expression using localized transcriptional environments and that active svb enhancers tended to colocalize, even when placed on different chromosomes (Tsai et al., 2017). Here, we test the hypothesis that these multi-enhancer "hubs" improve robustness by increasing transcription factor retention near transcription sites. Deleting a redundant enhancer from the svb locus led to reduced trichome numbers in embryos raised at elevated temperatures. Using high-resolution fluorescence microscopy, we observed lower Ubx concentration and transcriptional output in this deletion allele. Transcription sites of the full svb cis-regulatory region inserted into a different chromosome colocalized with the svb locus, increasing Ubx concentration, the transcriptional output of svb, and partially rescuing the phenotype. Thus, multiple enhancers could reinforce a local transcriptional hub to buffer against environmental stresses and genetic perturbations, providing a mechanism for phenotypical robustness.

ABSTRACT Developmental enhancers are DNA sequences that when bound to transcription factors dictate specific patterns of gene expression during development. It has been proposed that the evolution of such cis-regulatory elements is a major source of adaptive evolution; however, the regulatory and evolutionary potential of such elements remains little understood, masked by selective constraints, drift and contingency. Here, using mutation libraries in Drosophila melanogaster embryos, we observed that most mutations in classical developmental enhancers led to changes in gene expression levels but rarely resulted in novel expression outside of the native cell- and tissue-types. In contrast, random sequences often acted as developmental enhancers, driving expression across a range of levels and cell-types, in patterns consistent with transcription factor motifs therein; random sequences including motifs for transcription factors with pioneer activity acted as enhancers even more frequently and resulting in higher levels of expression. Together, our findings suggest that the adaptive phenotypic landscapes of developmental enhancers are constrained by both enhancer architecture and chromatin accessibility. We propose that the evolution of existing enhancers is limited in its capacity to generate novel phenotypes, whereas the activity of de novo elements is a primary source of phenotypic novelty. QUOTE “Chance and chance alone has a message for us.” Milan Kundera, The Unbearable Lightness of Being

Gene regulatory changes underlie much of phenotypic evolution. However, the evolutionary potential of regulatory evolution is unknown, because most evidence comes from either natural variation or limited experimental perturbations. Surveying an unbiased mutation library for a developmental enhancer in Drosophila melanogaster using an automated robotics pipeline, we found that most mutations alter gene expression. Our results suggest that regulatory information is distributed throughout most of a developmental enhancer and that parameters of gene expression: levels, location, and state, are convolved. The widespread pleiotropic effects of most mutations and the codependency of outputs may constrain the evolvability of developmental enhancers. Consistent with these observations, comparisons of diverse drosophilids reveal mainly stasis and apparent biases in the phenotypes influenced by this enhancer. Developmental enhancers may encode a much higher density of regulatory information than has been appreciated previously, which may impose constraints on regulatory evolution.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Biophysical constraints limit the specificity with which transcription factors (TFs) can target regulatory DNA. While individual nontarget binding events may be low affinity, the sheer number of such interactions could present a challenge for gene regulation by degrading its precision or possibly leading to an erroneous induction state. Chromatin can prevent nontarget binding by rendering DNA physically inaccessible to TFs, at the cost of energy-consuming remodeling orchestrated by pioneer factors (PFs). Under what conditions and by how much can chromatin reduce regulatory errors on a global scale? We use a theoretical approach to compare two scenarios for gene regulation: one that relies on TF binding to free DNA alone, and one that uses a combination of TFs and chromatin-regulating PFs to achieve desired gene expression patterns. We find, first, that chromatin effectively silences groups of genes that should be simultaneously OFF, thereby allowing more accurate graded control of expression for the remaining ON genes. Second, chromatin buffers the deleterious consequences of nontarget binding as the number of OFF genes grows, permitting a substantial expansion in regulatory complexity. Third, chromatin-based regulation productively co-opts nontarget TF binding for ON genes in order to establish a “leaky” baseline expression level, which targeted activator or repressor binding subsequently up- or down-modulates. Thus, on a global scale, using chromatin simultaneously alleviates pressure for high specificity of regulatory interactions and enables an increase in genome size with minimal impact on global expression error. Significance Statement Reliably keeping a gene off is as important as controlling its expression level when the gene is on. Yet both tasks become challenging in the packed nuclear environment of a eukaryotic cell, where the numerous and diverse regulatory proteins that are present cannot bind enhancers for target genes with perfect specificity. While regulatory schemes based on prokaryotic models would be overwhelmed by errors in such conditions, we show that chromatin-based regulation, an evolutionary innovation of eukaryotic cells, successfully rescues precise gene expression control by reliably keeping desired genes off. Our systems-level computational analysis demonstrates that this result is nontrivial, because chromatin opening must itself be correctly regulated. We furthermore identify when and how chromatin-based regulation outperforms alternative schemes.

Abstract The characterization of phenotypes in cells or organisms from microscopy data largely depends on differences in the spatial distribution of image intensity. Multiple methods exist for quantifying the intensity distribution - or image texture - across objects in natural images. However, many of these texture extraction methods do not directly adapt to 3D microscopy data. Here, we present Spherical Texture extraction, which measures the variance in intensity per angular wavelength by calculating the Spherical Harmonics or Fourier power spectrum of a spherical or circular projection of the angular mean intensity of the object. This method provides a 20-value characterization that quantifies the scale of features in the spherical projection of the intensity distribution, giving a different signal if the intensity is, for example, clustered in parts of the volume or spread across the entire volume. We apply this method to different systems and demonstrate its ability to describe various biological problems through feature extraction. The Spherical Texture extraction characterizes biologically defined gene expression patterns in Drosophila melanogaster embryos, giving a quantitative read-out for pattern formation. Our method can also quantify morphological differences in Caenorhabditis elegans germline nuclei, which lack a predefined pattern. We show that the classification of germline nuclei using their Spherical Texture outperforms a convolutional neural net when training data is limited. Additionally, we use a similar pipeline on 2D cell migration data to extract polarization direction, quantifying the alignment of fluorescent markers to the migration direction. We implemented the Spherical Texture method as a plugin in ilastik , making it easy to install and apply to any segmented 3D or 2D dataset. Additionally, this technique can also easily be applied through a Python package to provide extra feature extraction for any object classification pipeline or downstream analysis. Author summary We introduce a novel method to extract quantitative data from microscopy images by precisely measuring the distribution of intensities within objects in both 3D or 2D. This method is easily accessible through the object classification workflow of ilastik , provided the original image is segmented into separate objects. The method is specifically designed to analyze mostly convex objects, focusing on the variation in fluorescence intensity caused by differences in their shapes or patterns. We demonstrate the versatility of our method by applying it to very different biological samples. Specifically, we showcase its effectiveness in quantifying the patterning in D. melanogaster embryos, in classifying the nuclei in C. elegans germlines, and in extracting polarization information from individual migratory cells. Through these examples, we illustrate that our technique can be employed across different biological scales. Furthermore, we highlight the multiple ways in which the data generated by our method can be used, including quantifying the strength of a specific pattern, employing machine learning to classify diverse morphologies, or extracting directionality or polarization from fluorescence intensity.