Abstract Hematopoietic stem and progenitor cells develop from the hemogenic endothelium located in various sites during development, including the dorsal aorta from where Hematopoietic Stem Cells (HSCs) emerge. This process has proven especially challenging to recapitulate in vitro from pluripotent stem cells and further studies are needed to pinpoint the missing stimuli in vitro . Here, we compared iPSC-derived endothelial cells and in vivo HSC-primed hemogenic endothelium and identified 9 transcription factors expressed at significantly lower levels in cells generated in vitro . Using a novel DOX-inducible CRISPR activation system we induced the expression of those genes during in vitro differentiation. To study the phenotypical changes induced by the activation of target genes, we employed single cell RNA sequencing in combination with engineered gRNA that are detectable within the sequencing pipeline. Our data showed a significant expansion of arterial-fated endothelial cells associated with a higher in vitro progenitor activity. The expanded arterial cluster was marked by high expression of IGFBP2 and it was distinct from the hemogenic cluster that showed increased cell cycle progression. We demonstrated that the addition of IGFBP2 to differentiating PSCs resulted in a higher number of functional progenitors, identifying the supporting role of arterial cells play to the emergence of blood progenitors via IGFBP2 paracrine signalling.

Abstract A major challenge in the stem cell biology field is the ability to produce fully functional cells from induced pluripotent stem cells (iPSCs) that are a valuable resource for cell therapy, drug screening and disease modelling. Here we developed a novel inducible CRISPR-mediated activation strategy (iCRISPRa) to drive the expression of multiple endogenous transcription factors important for in vitro cell fate and differentiation of iPSCs to haematopoietic progenitor cells and used this to identify a key paracrine role for IGFBP2 in the development of hematopoietic progenitors. We first identified nine candidate transcription factors that we predicted to be involved in blood cell emergence during development, then generated novel gRNAs directed to the transcriptional start site of these transcription factors that could also be detected during scRNAseq. iCRISPRa activation of these endogenous transcription factors resulted in a significant expansion of arterial-fated endothelial cells expressing high levels of IGFBP2 and showed that IGFBP2 remodels the metabolic activity during in vitro endothelial to hematopoietic transition. As well as providing fundamental new insights into the mechanisms of haematopoietic cell fate and differentiation, the broader applicability of iCRISPRa provides a valuable tool for studying dynamic processes controlling developmental events as well as for recapitulating abnormal phenotypes characterised by ectopic activation of specific endogenous gene expression in a wide range of systems.

Abstract Congenital dyserythropoietic anaemia (CDA) type IV has been associated with an amino acid substitution, Glu325Lys (E325K), in the transcription factor KLF1. These patients present with a range of symptoms, including the persistence of nucleated red blood cells (RBCs) in the peripheral blood which reflects the known role for KLF1 within the erythroid cell lineage. The final stages of RBCs maturation and enucleation take place within the erythroblastic island (EBI) niche in close association with EBI macrophages. It is not known whether the detrimental effects of the E325K mutation in KLF1 are restricted to the erythroid lineage or whether deficiencies in macrophages associated with their niche also contribute to the disease pathology. To address this question, we generated an in vitro model of the human EBI niche using induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from a CDA type IV patient as well as iPSCs genetically modified to express an KLF1-E325K-ER T2 protein that could be activated with 4OH-tamoxifen. CDA patient-derived iPSCs and iPSCs expressing the activated KLF1-E325K-ER T2 protein showed significant deficiencies in the production of erythroid cells with associated disruption of some known KLF1 target genes. Macrophages could be generated from all iPSC lines but when the E325K-ER T2 fusion protein was activated, we noted the generation of a slightly less mature macrophage population marked by CD93. A subtle reduction in their ability to support RBC maturation was also associated with macrophages carrying the E325K-ER T2 transgene. Taken together these data support the notion that the clinically significant effects of the KLF1-E325K mutation are primarily associated with deficiencies in the erythroid lineage but that deficiencies in the niche might have the potential to exacerbate the condition. The strategy we describe provides a powerful approach to assess the effects of other mutations in KLF1 as well as other factors associated with the EBI niche.