The three types of peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR), termed alpha, delta (or beta), and gamma, belong to the nuclear receptor superfamily. Although peroxisome proliferators, including fibrates and fatty acids, activate the transcriptional activity of these receptors, only prostaglandin J2 derivatives have been identified as natural ligands of the PPAR gamma subtype that also binds thiazolidinedione antidiabetic agents with high affinity. PPARs heterodimerize with retinoic X receptor (RXR) and alter the transcription of target genes after binding to response elements or PPREs, consisting of a direct repeat of the nuclear receptor hexameric DNA recognition motif (PuGGTCA) spaced by 1 nucleotide (DR-1). Upon activation by fatty acids (FAs) and drugs that affect lipid metabolism, PPARs control the expression of genes implicated in intra- and extracellular lipid metabolism, most notably those involved in peroxisomal beta-oxidation. PPARs partially mediate the inductive effects of fibrates and fatty acids on high density lipoprotein (HDL) cholesterol levels by regulating the transcription of the major HDL apolipoproteins, apoA-I and apoA-II. The hypotriglyceridemic action of fibrates and certain fatty acids also involves PPAR and is constituted of: 1) increased hydrolysis of plasma triglycerides due to induction of LPL and reduction of apoC-III expression; 2) stimulation of cellular fatty acid uptake and conversion to acyl-CoA derivatives due to increased expression of genes for fatty acid transport protein and acyl-CoA synthetase; 3) increased peroxisomal and mitochondrial beta-oxidation; and 4) decreased synthesis of fatty acids and triglycerides and decreased production of very low density lipoprotein (VLDL). Hence, both enhanced catabolism of triglyceride-rich particles and reduced secretion of VLDL particles contribute to the hypolipidemic effect of fibrates and fatty acids. Finally, PPARs appear to be involved in differentiation processes because activation of PPAR gamma 2 triggers adipocyte differentiation and stimulates expression of several genes critical to adipogenesis. It is suggested that PPARs are key messengers responsible for the translation of nutritional and pharmacological stimuli into changes in gene expression and differentiation pathways.

Th1 cytokines promote monocyte differentiation into proatherogenic M1 macrophages, while Th2 cytokines lead to an "alternative" anti-inflammatory M2 macrophage phenotype. Here we show that in human atherosclerotic lesions, the expression of M2 markers and PPARgamma, a nuclear receptor controlling macrophage inflammation, correlate positively. Moreover, PPARgamma activation primes primary human monocytes into M2 differentiation, resulting in a more pronounced anti-inflammatory activity in M1 macrophages. However, PPARgamma activation does not influence M2 marker expression in resting or M1 macrophages, nor does PPARgamma agonist treatment influence the expression of M2 markers in atherosclerotic lesions, indicating that only native monocytes can be primed by PPARgamma activation to an enhanced M2 phenotype. Furthermore, PPARgamma activation significantly increases expression of the M2 marker MR in circulating peripheral blood mononuclear cells. These data demonstrate that PPARgamma activation skews human monocytes toward an anti-inflammatory M2 phenotype.

PPARγ is a member of the PPAR subfamily of nuclear receptors. In this work, the structure of the human PPARγ cDNA and gene was determined, and its promoters and tissue-specific expression were functionally characterized. Similar to the mouse, two PPAR isoforms, PPARγ1 and PPARγ2, were detected in man. The relative expression of human PPARγ was studied by a newly developed and sensitive reverse transcriptase-competitive polymerase chain reaction method, which allowed us to distinguish between PPARγ1 and γ2 mRNA. In all tissues analyzed, PPARγ2 was much less abundant than PPARγ1. Adipose tissue and large intestine have the highest levels of PPARγ mRNA; kidney, liver, and small intestine have intermediate levels; whereas PPARγ is barely detectable in muscle. This high level expression of PPARγ in colon warrants further study in view of the well established role of fatty acid and arachidonic acid derivatives in colonic disease. Similarly as mouse PPARγs, the human PPARγs are activated by thiazolidinediones and prostaglandin J and bind with high affinity to a PPRE. The human PPARγ gene has nine exons and extends over more than 100 kilobases of genomic DNA. Alternate transcription start sites and alternate splicing generate the PPARγ1 and PPARγ2 mRNAs, which differ at their 5′-ends. PPARγ1 is encoded by eight exons, and PPARγ2 is encoded by seven exons. The 5′-untranslated sequence of PPARγ1 is comprised of exons A1 and A2, whereas that of PPARγ2 plus the additional PPARγ2-specific N-terminal amino acids are encoded by exon B, located between exons A2 and A1. The remaining six exons, termed 1 to 6, are common to the PPARγ1 and γ2. Knowledge of the gene structure will allow screening for PPARγ mutations in humans with metabolic disorders, whereas knowledge of its expression pattern and factors regulating its expression could be of major importance in understanding its biology. PPARγ is a member of the PPAR subfamily of nuclear receptors. In this work, the structure of the human PPARγ cDNA and gene was determined, and its promoters and tissue-specific expression were functionally characterized. Similar to the mouse, two PPAR isoforms, PPARγ1 and PPARγ2, were detected in man. The relative expression of human PPARγ was studied by a newly developed and sensitive reverse transcriptase-competitive polymerase chain reaction method, which allowed us to distinguish between PPARγ1 and γ2 mRNA. In all tissues analyzed, PPARγ2 was much less abundant than PPARγ1. Adipose tissue and large intestine have the highest levels of PPARγ mRNA; kidney, liver, and small intestine have intermediate levels; whereas PPARγ is barely detectable in muscle. This high level expression of PPARγ in colon warrants further study in view of the well established role of fatty acid and arachidonic acid derivatives in colonic disease. Similarly as mouse PPARγs, the human PPARγs are activated by thiazolidinediones and prostaglandin J and bind with high affinity to a PPRE. The human PPARγ gene has nine exons and extends over more than 100 kilobases of genomic DNA. Alternate transcription start sites and alternate splicing generate the PPARγ1 and PPARγ2 mRNAs, which differ at their 5′-ends. PPARγ1 is encoded by eight exons, and PPARγ2 is encoded by seven exons. The 5′-untranslated sequence of PPARγ1 is comprised of exons A1 and A2, whereas that of PPARγ2 plus the additional PPARγ2-specific N-terminal amino acids are encoded by exon B, located between exons A2 and A1. The remaining six exons, termed 1 to 6, are common to the PPARγ1 and γ2. Knowledge of the gene structure will allow screening for PPARγ mutations in humans with metabolic disorders, whereas knowledge of its expression pattern and factors regulating its expression could be of major importance in understanding its biology. White adipose tissue is composed of adipocytes, which play a central role in lipid homeostasis and the maintenance of energy balance in vertebrates. These cells store energy in the form of triglycerides during periods of nutritional affluence and release it in the form of free fatty acids at times of nutritional deprivation. Excess of white adipose tissue leads to obesity (1Auwerx J. Martin G. Guerre-Millo G. Staels B. J. Mol. Med. 1996; 74: 347-352Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar, 2Flier J.S. Cell. 1995; 80: 15-18Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (267) Google Scholar, 3Spiegelman B.M. Flier J.S. Cell. 1996; 87: 377-389Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1156) Google Scholar), whereas its absence is associated with lipodystrophic syndromes (4Moller D.E. Flier J.S. N. Engl. J. Med. 1991; 325: 938-948Crossref PubMed Scopus (767) Google Scholar). In contrast to the development of brown adipose tissue, which mainly takes place before birth, the development of white adipose tissue is the result of a continuous differentiation/development process throughout life (2Flier J.S. Cell. 1995; 80: 15-18Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (267) Google Scholar, 5Auwerx, J., Schoonjans, K., Fruchart, J. C., and Staels, B. (1996)Atherosclerosis , 124, (suppl.) S29–S37.Google Scholar). During development, cells that are pluripotent become increasingly restricted to specific differentiation pathways. Adipocyte differentiation results from coordinate changes in the expression of several proteins, which are mostly involved in lipid storage and metabolism, that give rise to the characteristic adipocyte phenotype. The changes in expression of these specialized proteins are mainly the result of alterations in the transcription rates of their genes. Several transcription factors including the nuclear receptor PPARγ (6Tontonoz P. Hu E. Graves R.A. Budavari A.I. Spiegelman B.M. Genes & Dev. 1994; 8: 1224-1234Crossref PubMed Scopus (1996) Google Scholar, 7Tontonoz P. Hu E. Spiegelman B.M. Cell. 1994; 79: 1147-1156Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3114) Google Scholar), the family of CCAATT enhancer binding proteins (C/EBP) 1The abbreviations used are: C/EBP, CCAATT enhancer binding protein; LPL, lipoprotein lipase; kb, kilobase(s); bp, base pair(s); UTR, untranslated region; RACE, rapid amplification of cDNA ends; EMSA, electrophoretic mobility shift assays; ACO, acyl-CoA oxidase; PAC, P1-derived artificial chromosome; PPRE, peroxisome proliferator response element; NIDDM, non-insulin-dependent diabetes mellitus. 1The abbreviations used are: C/EBP, CCAATT enhancer binding protein; LPL, lipoprotein lipase; kb, kilobase(s); bp, base pair(s); UTR, untranslated region; RACE, rapid amplification of cDNA ends; EMSA, electrophoretic mobility shift assays; ACO, acyl-CoA oxidase; PAC, P1-derived artificial chromosome; PPRE, peroxisome proliferator response element; NIDDM, non-insulin-dependent diabetes mellitus. (8Freytag S.O. Geddes T.J. Science. 1992; 256: 379-382Crossref PubMed Scopus (250) Google Scholar, 9Freytag S.O. Paielli D.L. Gilbert J.D. Genes & Dev. 1994; 8: 1654-1663Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar, 10Christy R.J. Yang V.W. Ntambi J.M. Geiman D.E. Landschulz W.H. Friedman A.D. Nakabeppu Y. Kelly T.J. Lane M.D. Genes & Dev. 1989; 3: 1323-1335Crossref PubMed Scopus (466) Google Scholar, 11Wu Z. Xie Y. Bucher N.L.R. Farmer S.R. Genes & Dev. 1995; 9: 2350-2363Crossref PubMed Scopus (478) Google Scholar, 12Wu Z. Bucher N.L.R. Farmer S.R. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 4128-4136Crossref PubMed Google Scholar, 13Yeh W.C. Cao Z. Classon M. McKnight S. Genes & Dev. 1995; 9: 168-181Crossref PubMed Scopus (809) Google Scholar) and the basic helix-loop-helix leucine zipper transcription factor ADD1/SREBP1 (14Tontonoz P. Kim J.B. Graves R.A. Spiegelman B.M. Mol. Cell. Biol. 1993; 13: 4753-4759Crossref PubMed Scopus (534) Google Scholar,15Kim J.B. Spiegelman B.M. Genes & Dev. 1996; 10: 1096-1107Crossref PubMed Scopus (842) Google Scholar) orchestrate the adipocyte differentiation process (for reviews, see Refs. 1Auwerx J. Martin G. Guerre-Millo G. Staels B. J. Mol. Med. 1996; 74: 347-352Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar, 3Spiegelman B.M. Flier J.S. Cell. 1996; 87: 377-389Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1156) Google Scholar, 16Schoonjans K. Staels B. Auwerx J. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1302: 93-109Crossref PubMed Scopus (907) Google Scholar, 17Schoonjans K. Staels B. Auwerx J. J. Lipid Res. 1996; 37: 907-925Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 18Cornelius P. MacDougald O.A. Lane M.D. Annu. Rev. Nutr. 1994; 14: 99-129Crossref PubMed Scopus (572) Google Scholar). In contrast to the wide tissue distribution of the various C/EBPs, PPARγ has been shown to have an adipose-restricted pattern of expression in mouse. The currently favored hypothesis is that C/EBPβ and δ induce the expression of PPARγ (11Wu Z. Xie Y. Bucher N.L.R. Farmer S.R. Genes & Dev. 1995; 9: 2350-2363Crossref PubMed Scopus (478) Google Scholar), which then triggers the adipogenic program. Terminal differentiation then requires the concerted action of both PPARγ, C/EBPα, and ADD-1/SREBP1 (7Tontonoz P. Hu E. Spiegelman B.M. Cell. 1994; 79: 1147-1156Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3114) Google Scholar,15Kim J.B. Spiegelman B.M. Genes & Dev. 1996; 10: 1096-1107Crossref PubMed Scopus (842) Google Scholar). Several arguments support the important role of PPARγ in adipocyte differentiation. First, overexpression of PPARγ by itself can induce adipocyte conversion of fibroblasts (6Tontonoz P. Hu E. Graves R.A. Budavari A.I. Spiegelman B.M. Genes & Dev. 1994; 8: 1224-1234Crossref PubMed Scopus (1996) Google Scholar). In addition, PPARγ together with C/EBPα can induce transdifferentiation of myoblasts into adipocytes (19Hu E. Tontonoz P. Spiegelman B.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 9856-9860Crossref PubMed Scopus (581) Google Scholar). Second, the description of functional PPREs in the regulatory sequences of several of the genes that are induced during adipocyte differentiation, such as the genes coding for adipocyte fatty acid binding protein, aP2 (6Tontonoz P. Hu E. Graves R.A. Budavari A.I. Spiegelman B.M. Genes & Dev. 1994; 8: 1224-1234Crossref PubMed Scopus (1996) Google Scholar), phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) (20Tontonoz P. Hu E. Devine J. Beale E.G. Spiegelman B.M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 351-357Crossref PubMed Google Scholar), acyl-CoA synthetase (ACS) (21Schoonjans K. Staels B. Grimaldi P. Auwerx J. Eur. J. Biochem. 1993; 216: 615-622Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar, 22Schoonjans K. Watanabe M. Suzuki H. Mahfoudi A. Krey G. Wahli W. Grimaldi P. Staels B. Yamamoto T. Auwerx J. J. Biol. Chem. 1995; 270: 19269-19276Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (355) Google Scholar), and lipoprotein lipase (LPL) (23Schoonjans K. Peinado-Onsurbe J. Heyman R. Briggs M. Cayet D. Deeb S. Staels B. Auwerx J. EMBO J. 1996; 15: 5336-5348Crossref PubMed Scopus (1017) Google Scholar), is consistent with the crucial role attributed to PPARγ in adipocyte differentiation. Finally, PPAR activators, such as fibrates (24Brandes R. Hertz R. Arad R. Naishtat S. Weil S. Bar-Tana J. Life Sci. 1987; 40: 935-941Crossref PubMed Scopus (24) Google Scholar, 25Gharbi-Chibi J. Teboul M. Bismuth J. Bonne J. Torresani J. Biochim. Biophys. Acta. 1993; 1177: 8-14Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar) and fatty acids (7Tontonoz P. Hu E. Spiegelman B.M. Cell. 1994; 79: 1147-1156Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3114) Google Scholar, 26Amri E.-Z. Bertrand B. Ailhaud G. Grimaldi P. J. Lipid Res. 1991; 32: 1449-1456Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 27Chawla A. Lazar M.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 1786-1790Crossref PubMed Scopus (218) Google Scholar, 28Kliewer S.A. Lenhard J.M. Willson T.M. Patel I. Morris D.C. Lehman J.M. Cell. 1995; 83: 813-819Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1863) Google Scholar), or synthetic PPARγ ligands, such as the thiazolidinediones (7Tontonoz P. Hu E. Spiegelman B.M. Cell. 1994; 79: 1147-1156Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3114) Google Scholar, 28Kliewer S.A. Lenhard J.M. Willson T.M. Patel I. Morris D.C. Lehman J.M. Cell. 1995; 83: 813-819Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1863) Google Scholar, 29Forman B.M. Tontonoz P. Chen J. Brun R.P. Spiegelman B.M. Evans R.M. Cell. 1995; 83: 803-812Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2721) Google Scholar), induce adipocyte differentiation. In this context, it is interesting to note that prostanoids, which are potent inducers of adipose differentiation programs (30Gaillard D. Negrel R. Lagarde M. Ailhaud G. Biochem. J. 1989; 257: 389-397Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar, 31Negrel R. Gaillard D. Ailhaud G. Biochem. J. 1989; 257: 399-405Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar, 32Aubert J. Ailhaud G. Negrel R. FEBS Lett. 1996; 397: 117-121Crossref PubMed Scopus (40) Google Scholar), may be one of the natural ligands of PPARγ. In addition to PPARγ, PPARα, but not PPARδ, has been shown to have some, albeit weaker, adipogenic activity (33Brun R.P. Tontonoz P. Forman B.M. Ellis R. Chen J. Evans R.M. Spiegelman B.M. Genes & Dev. 1996; 10: 974-984Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar). To better understand the physiological role of PPARγ in human physiology, it is crucial that we gain insight into the regulation of PPARγ gene expression in man. Therefore, we cloned the human PPARγ cDNAs, determined the structure of the human PPARγ gene, and studied the expression of the PPARγ mRNAs and the regulation of their promoter. Both PPARγ1 and 2 are produced in human tissues but PPARγ2 appears to be the minor isoform in man. In addition to adipose tissue, which contains high levels of PPARγ, we demonstrate high level expression of human PPARγ in the colon. The structure of the gene encoding the mouse and human PPARγs is highly conserved. Furthermore our results demonstrate that 3 and 1 kb of DNA upstream of the transcription start sites of PPARγ1 and γ2, respectively, are sufficient to control basal and tissue-specific PPARγ gene expression. The oligonucleotides used for various experiments in this manuscript are listed in Table I.Table IOligonucleotides used in this study listed from 5′ to 3′NameSequenceLF-2TCTCCGGTGTCCTCGAGGCCGACCCAALF-14AGTGAAGGAATCGCTTTCTGGGTCAATLF-18AGCTGATCCCAAAGTTGGTGGGCCAGALF-20CATTCCATTCACAAGAACAGATCCAGTGGTLF-21GGCTCTTCATGAGGCTTATTGTAGAGCTGALF-22GCAATTGAATGTCGTGTCTGTGGAGATAALF-23GTGGATCCGACAGTTAAGATCACATCTGTLF-24GTAGAAATAAATGTCAGTACTGTCGGTTTCLF-25TCGATATCACTGGAGATCTCCGCCAACAGLF-26ACATAAAGTCCTTCCCGCTGACCAAAGCAALF-27CTCTGCTCCTGCAGGGGGGTGATGTGTTTLF-28GAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACALF-29GAGCTCCAGGGGTTGTAGCAGGTTGTCTTLF-33GACGGGCTGAGGAGAAGTCACACTCTGALF-35AGCATGGAATAGGGGTTTGCTGTAATTCLF-36TAGTACAAGTCCTTGTAGATCTCCLF-44GTCGGCCTCGAGGACACCGGAGAGLF-58CACTCATGTGACAAGACCTGCTCCLF-59GCCGACACTAAACCACCAATATACLF-60CGTTAAAGGCTGACTCTCGTTTGAAII J PPREGATCCTTCAACCTTTACCCTGGTAGAACO PPREGATCCCGAACGTGACCTTTGTCCTGGTCCCLPL PPREGATCCGTCTGCCCTTTCCCCCTCTTCAγASGCATTATGAGCATCCCCACγSTCTCTCCGTAATGGAAGACCγ2SGCGATTCCTTCACTGATACCDSTTCTAGAATTCAGCGGCCGC(T)30(G/A/C)(G/A/C/T) Open table in a new tab A human adipose tissue λgt11 library was screened with a random primed 32P-labeled 200 bp fragment, covering the DNA-binding domain of the mouse PPARγ cDNA. After hybridization, filters were washed in 2 × SSC, 0.1% SDS for 10 min at 20 °C and twice for 30 min in 1 × SSC, 0.1% SDS at 50 °C and subsequently exposed to x-ray film (X-OMAT-AR, Kodak). Of several positive clones, one clone 407 was characterized in detail. The insert of this clone, starting ±90 bp upstream of the ATG start codon and extending downstream into the 3′-untranslated region (UTR) sequence, was subcloned in the EcoRI site of pBluescript SK− to generate clone 407.2. Sequence analysis of 407.2 confirmed it as being the human homologue of the mouse PPARγ2 cDNA. While this work was in progress, other groups also reported the isolation of human PPARγ2 cDNA clones (34Elbrecht A. Chen Y. Cullinan C.A. Hayes N. Leibowitz M.D. Moller D.E. Berger J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 224: 431-437Crossref PubMed Scopus (353) Google Scholar, 35Lambe K.G. Tugwood J.D. Eur. J. Biochem. 1996; 239: 1-7Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar). To isolate genomic P1-derived artificial chromosome (PAC) clones containing the entire human PPARγ gene, the primer pair LF-3 and LF-14 was used to amplify an 86-bp probe with human genomic DNA as template. This fragment was then used to screen a PAC human genomic library from human foreskin fibroblasts. Three positive clones, P-8854, P-8855, and P-8856, were isolated. Restriction digestion and Southern blotting were performed according to classical protocols as described by Sambrook et al. (36Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). Sequencing reactions were performed, according to the manufacturer instructions, using the T7 sequencing kit (Pharmacia Biotech Inc.). The oligonucleotide LF-35 was32P-labeled with T4-polynucleotide kinase (Amersham Life Science, Inc) to a specific activity of 107 dpm/50 ng and purified by gel electrophoresis. For primer extension, 105dpm of oligonucleotide was added in a final volume of 100 μl to 50 μg of adipose tissue total RNA isolated from different patients. Primer extension analysis was performed following standard protocols utilizing a mixture of 1.25 units of avian mycloblastosis virus reverse transcriptase (Life Technologies, Inc.) and 100 units of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Life Technologies, Inc.). A sequencing reaction and molecular mass standards were used to map the 5′-end of the extension products. The Marathon cDNA amplification kit (CLONTECH) was used to obtain a library of adaptor-ligated double-stranded cDNA from human adipose tissue. 1 μg of poly(A)+ RNA was used as a template for the first strand synthesis, with the 52-mer CDS primer and 100 units of the MMLV reverse transcriptase in a total volume of 10 μl. Synthesis was carried out at 42 °C for 1 h. Next, the second strand was synthetized at 16 °C for 90 min in a total volume of 80 μl containing the enzyme mixture (RNase H, Escherichia coli DNA polymerase I, and E. coli DNA ligase), the second strand buffer, the dNTP mix, and the first strand reaction. cDNA ends were then made blunt by adding to the reaction 10 units of T4 DNA polymerase and incubating at 16 °C for 45 min. The double-stranded cDNA was phenol/chloroform extracted, ethanol precipitated, and resuspended in 10 μl of water. Half of this volume was used to ligate the adaptor to the cDNA ends (adaptor sequence CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT) in a total volume of 10 μl using 1 unit of T4 DNA ligase. The ligation reaction was incubated 16 h at 16 °C. The resulting cDNA library was diluted to a final concentration of 0.1 mg/ml. The 5′-end of PPARγ1 was PCR-amplified using 5 μl of the library as a template with the oligonucleotides AP-1 (binding to the adaptor) and LF-45 (binding antisense to the 5′-end of the PPARγ1). After an initial denaturing step at 95 °C for 3 min, 25 cycles were done at the following conditions: 10 s at 95 °C, 20 s at 60 °C, and 30 s at 72 °C. The resulting PCR product was reamplified for 30 additional cycles at the same conditions using the nested oligonucleotides AP2 (nested to AP1) and LF-2 (nested to LF-45). The PCR product was analyzed on a 2% agarose gel, treated withPfu polymerase (Stratagene) and cloned into theEcoRV site of pBluescript SK+. A total of 20 white colonies were grown and sequenced from both ends using the oligonucleotides T3 and T7 (Dye Terminator Cycle sequencing kit, Applied Biosystems). For the determination of the 5′-end of PPARγ2, the same procedure was followed except that the oligonucleotide LF-14 (specific for the PPARγ2 5′-UTR) was used in the first round PCR, and the oligonucleotide LF-35 (nested to LF-14) was used in the second round PCR with the same cycling conditions. Omental adipose tissue, small and large intestine, kidney, muscle, and liver biopsies were obtained from non-obese adult subjects undergoing elective surgery or endoscopy. All subjects had fasted overnight before surgery (between 8.00 p.m. and 10 a.m.) and received intravenous saline infusion. They had given informed consent, and the project was approved by the ethics committee of the University of Lille. All tissue was immediately frozen in liquid nitrogen until RNA preparation. Standard cell culture conditions were used to maintain 3T3-L1 (obtained from ATCC), CV-1 (a kind gift from Dr. R. Evans, Salk Institute, La Jolla, CA), and Hep G2 cells (ATCC). BRL-49,653, supplied by Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA (in DMSO) and fatty acids (in ethanol) were added to the medium at the concentrations and times indicated. Control cells received vehicle only. Fatty acids were complexed to serum albumin contained in delipidated and charcoal-treated fetal calf serum by preincubation for 45 min at 37 °C. RNA preparation of total cellular RNA was performed as described previously (37Saladin R. De Vos P. Guerre-Millo M. Leturque A. Girard J. Staels B. Auwerx J. Nature. 1995; 377: 527-529Crossref PubMed Scopus (1092) Google Scholar). The absolute mRNA concentration of the differentially spliced PPARγ variants was measured by reverse transcription reaction followed by competitive polymerase chain reaction (RT-competitive PCR) in the presence of known amounts of competitor DNA yielding amplicons of different size allowing the separation and the quantification of the PCR products. The competitor was constructed by deletion of a 74-bp fragment (nucleotides +433 to +507 by HindIII digestion) of PPARγ1 cloned into pBluescript KS+, yielding pBSCompPPARγ. Working solution of the competitor was prepared by in vitro transcription followed by serial dilution in 10 mm Tris-HCl (pH 8.3), 1 mm EDTA buffer. For RT-competitive PCR, the antisense primer hybridized to the 3′-end of exon 3 (γAS:5′-GCATTATGAGCATCCCCAC-3′, nt +600 to +620) and the sense primer to exon 1 (γS:5′-TCTCTCCGTAATGGAAGACC-3′, nt +146 to +165) or to the B exon (γ2S:5′-GCGATTCCTTCACTGATAC-3′, nt +41 to +59). Therefore, the same competitor served to measure either total PPARγ mRNAs (γ1 + γ2; with primers γAS and γS) or, specifically, PPARγ2 mRNA (with primers γAS and γ2S). The γAS/γS primer pair gave PCR products of 474 and 400 bp for the PPARγ mRNAs and competitor, respectively. The primer pair γAS/γ2S gave 580 bp for PPARγ2 mRNA and 506 bp for the competitor. For analysis of the PCR products, the sense primers γS and γ2S were 5′-end labeled with the fluorescent dye Cy-5 (Eurogentec, Belgium). First-strand cDNA synthesis was performed from total RNA (0.1 μg) in the presence of the antisense primer γAS (15 pmol) and of thermostable reverse transcriptase (2.5 units; Tth DNA polymerase, Promega) as described (38Vidal H. Auboeuf D. De Vos P. Staels B. Riou J.P. Auwerx J. Laville M. J. Clin. Invest. 1996; 98: 251-255Crossref PubMed Scopus (184) Google Scholar). After the reaction, half of the RT volume was added to the PCR mix (90 μl) containing the primer pair γAS/γS for the assay of PPARγ total mRNA, whereas the other half was added to a PCR mix (10 mm Tris-HCl, pH 8.3, 100 mm KCl, 0.75 m EGTA, 5% glycerol, 0.2 mm dNTP, 5 units of Taq polymerase) containing the primer pair γAS/γ2S for the assay of PPARγ2 mRNA. Four aliquots (20 μl) of the mixture were then transferred to microtubes containing a different, but known, amount of competitor. After 120 s at 95 °C, the samples were subjected to 40 PCR cycles (40 s at 95 °C, 50 s at 55 °C, and 50 s at 72 °C). The fluorescent-labeled PCR products were analyzed by 4% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis using an automated laser fluorescence DNA sequencer (ALFexpress, Pharmacia, Uppsala, Sweden), and integration of the area under the curve using the Fragment manager software (Pharmacia) was performed as described (38Vidal H. Auboeuf D. De Vos P. Staels B. Riou J.P. Auwerx J. Laville M. J. Clin. Invest. 1996; 98: 251-255Crossref PubMed Scopus (184) Google Scholar). To validate this technique, human PPARγ2 mRNA was synthesized byin vitro transcription from the expression vector pSG5hPPARγ (Riboprobe system, Promega) and quantified by competitive PCR over a wide range of concentrations (0.25–25 attomole (amol) added in the RT reaction). Standard curves obtained when assaying PPARγ total mRNA or PPARγ2 mRNA are shown in Fig. 2 C. The linearity (r = 0.99) and the slopes of the standard curves (0.98 and 1.11) indicated that the RT-competitive PCR is quantitative and that all the mRNA molecules are copied into cDNA during the RT step. The lower limit of the assay was about 0.05 amol of mRNA in the RT reaction, and the interassay variation of the RT-competitive PCR was 7% with six separated determinations of the same amount of PPARγ mRNA. Cells and tissues were homogenized in a lysis buffer of PBS containing 1% Triton X-100 (Sigma). Tissues were homogenized in extraction buffer containing PBS and 1% Nonidet P-40 (Sigma), 0.5% sodium deoxycholate (Sigma), 0.1% SDS (Sigma). Fresh mixture protease inhibitor (ICN) was added (100 mg/ml AEBSF, 5 mg/ml EDTA, 1 mg/ml leupeptin, 1 mg/ml pepstatin). Protein extracts were obtained by centrifugation of the lysate at 4 °C, and concentration was measured with the Bio-Rad DC Protein colorimetric assay system. Protein (100 μg) was separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membrane (Amersham Life Science, Inc.), and blocked overnight in blocking buffer (20 mm Tris, 100 mm NaCl, 1% Tween-20, 10% skim milk). Filters were first incubated for 4 h at room temperature with rabbit IgG anti-mPPARγ (10 mg/ml), raised against an N-terminal PPARγ peptide (amino acids 20–104), and next developed for 1 h at room temperature with a goat anti-rabbit IgG (whole molecule) peroxidase conjugate (Sigma) diluted at 1/500. The complex was visualized with 4-chloro-1-naphtol as reagent. To test the activity of the human PPARγ promoters several reporter constructs were made. A 1-kb fragment of PAC clone 8856 was isolated by PCR using the oligonucleotides LF-35 (binding antisense in the PPARγ2 5′-UTR) and the oligonucleotide LF-58 (binding sense at position -1000 of the PPARγ2), was sequenced, and was inserted intoEcoRV site of pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA). After digestion of plasmid pBSγ2p1000 with SmaI andKpnI, the insert was cloned into the reporter vector pGL3 (Promega), creating the expression vector pGL3γ2p1000. To isolate the PPARγ1 promoter, an 8-kb EcoRI fragment, which hybridized with the oligonucleotide LF-2 (corresponding to the 5′-UTR of γ1), was cloned into pBluescript. Partial mapping and sequencing of this clone revealed the presence of a 3-kb fragment upstream of the transcription initiation site. To test for promoter activity, aSacI/XhoI digestion of this clone containing the 3-kb promoter was inserted in the same sites of pGL3, resulting in the final vector pGL3γ1p3000. The pSG5-haPPARγ (39Aperlo C. Pognonec P. Saladin R. Auwerx J. Boulukos K. Gene ( Amst. ). 1995; 162: 297-302Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar) and pMSV-C/EBPα (10Christy R.J. Yang V.W. Ntambi J.M. Geiman D.E. Landschulz W.H. Friedman A.D. Nakabeppu Y. Kelly T.J. Lane M.D. Genes & Dev. 1989; 3: 1323-1335Crossref PubMed Scopus (466) Google Scholar) expression vectors were described elsewhere. Transfections were carried out in 60-mm plates using standard calcium phosphate precipitation techniques (for 3T3-L1, CV-1, and COS cells) (22Schoonjans K. Watanabe M. Suzuki H. Mahfoudi A. Krey G. Wahli W. Grimaldi P. Staels B. Yamamoto T. Auwerx J. J. Biol. Chem. 1995; 270: 19269-19276Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (355) Google Scholar). Luciferase and β-galactosidase assays were carried out exactly as described previously (22Schoonjans K. Watanabe M. Suzuki H. Mahfoudi A. Krey G. Wahli W. Grimaldi P. Staels B. Yamamoto T. Auwerx J. J. Biol. Chem. 1995; 270: 19269-19276Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (355) Google Scholar). haPPARγ (39Aperlo C. Pognonec P. Saladin R. Auwerx J. Boulukos K. Gene ( Amst. ). 1995; 162: 297-302Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar), hPPARγ2, and mRXRα (40Leid M. Kastner P. Lyons R. Nakshatri H. Saunders M. Zacharewski T. Chen J.Y. Staub A. Garnier J.M. Mader S. Chambon P. Cell. 1992; 68: 377-395Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1019) Google Scholar) proteins were synthesized in vitro in rabbit reticulocyte lysate (Promega). Molecular weights and quality of the in vitrotranslated proteins were verified by SDS-PAGE. PPAR (2 μl) and/or RXR (2 μl) were incubated for 15 min on ice in a total volume of 20 μl with 1-ng probe, 2.5 μg of poly(dI-dC) and 1 μg of herring sperm DNA in binding buffer (10 mm Tris-HCl pH 7.9, 40 mm KCl, 10% glycerol, 0.05% Nonidet P-40, and 1 mm dithiothreitol). For competition experiments, increasing amounts (from 10- to 200-fold molar excess) of cold oligonucleotide (AII-J-PPRE, 5′-GATCCTTCAACCTTTACCCTGGTAGA-3′ (41Vu-Dac N. Schoonjans K. Kosykh V. Dallongeville J. Fruchart J.-C. Staels B. Auwerx J. J. Clin. Invest. 1995; 96: 741-750Crossref PubMed Scopus (364) Google Scholar); acyl-CoA oxidase (ACO)-PPRE, 5′-GATCCCGAACGTGACCTTTGTCCTGGTCCC-3′ (42Tugwood J.D. Isseman I. Anderson R.G. Bundell K.R. McPheat W.L. Green S. EMBO J. 1992; 11: 433-439Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar); or LPL-PPRE, 5′-GATCCGTCTGCCCTTTCCCCCTCTTCA-3′) (23Schoonjans K. Peinado-Onsurbe J. Heyman R. Briggs M. Cayet D. Deeb S. Staels B. Auwerx J. EMBO J. 1996; 15: 5336-5348Crossref PubMed Scopus (1017) Google Scholar) were included just before adding T4-PNK end-labeled AII-J-PPRE oligonucleotide. DNA-protein complexes were separated by electrophoresis on a 4% polyacrylamide gel in 0.25 × TBE buffer at 4 °C (43Fried M.G. Crothers D.M. Nucleic Acids Res. 1983; 11: 141-158Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar). A cDNA probe containing

Research Article1 October 1996free access PPARalpha and PPARgamma activators direct a distinct tissue-specific transcriptional response via a PPRE in the lipoprotein lipase gene. K. Schoonjans K. Schoonjans U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author J. Peinado-Onsurbe J. Peinado-Onsurbe U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author A. M. Lefebvre A. M. Lefebvre U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author R. A. Heyman R. A. Heyman U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author M. Briggs M. Briggs U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author S. Deeb S. Deeb U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author B. Staels B. Staels U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author J. Auwerx J. Auwerx U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author K. Schoonjans K. Schoonjans U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author J. Peinado-Onsurbe J. Peinado-Onsurbe U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author A. M. Lefebvre A. M. Lefebvre U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author R. A. Heyman R. A. Heyman U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author M. Briggs M. Briggs U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author S. Deeb S. Deeb U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author B. Staels B. Staels U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author J. Auwerx J. Auwerx U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. Search for more papers by this author Author Information K. Schoonjans1, J. Peinado-Onsurbe1, A. M. Lefebvre1, R. A. Heyman1, M. Briggs1, S. Deeb1, B. Staels1 and J. Auwerx1 1U325 INSERM, Département d'Athérosclérose, Institut Pasteur, Lille, France. The EMBO Journal (1996)15:5336-5348https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1996.tb00918.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Increased activity of lipoprotein lipase (LPL) may explain the hypotriglyceridemic effects of fibrates, thiazolidinediones and fatty acids, which are known activators (and/or ligands) of the various peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs). Treatment with compounds which activate preferentially PPARalpha, such as fenofibrate, induced LPL expression exclusively in rat liver. In contrast, the antidiabetic thiazolidinedione BRL 49653, a high affinity ligand for PPARgamma, had no effect on liver, but induced LPL expression in rat adipose tissue. In the hepatocyte cell line AML-12, fenofibric acid, but not BRL 49653, induced LPL mRNA, whereas in 3T3-L1 preadipocytes, the PPARgamma ligand induced LPL mRNA levels much quicker and to a higher extent than fenofibric acid. In both the in vivo and in vitro studies, inducibility by either PPARalpha or gamma activators, correlated with the tissue distribution of the respective PPARs: an adipocyte-restricted expression of PPARgamma, whereas PPARalpha was expressed predominantly in liver. A sequence element was identified in the human LPL promoter that mediates the functional responsiveness to fibrates and thiazolidinediones. Methylation interference and gel retardation assays demonstrated that a PPARalpha or gamma and the 9-cis retinoic acid receptor (RXR) heterodimers bind to this sequence −169 TGCCCTTTCCCCC −157. These data provide evidence that transcriptional activation of the LPL gene by fibrates and thiazolidinediones is mediated by PPAR-RXR heterodimers and contributes significantly to their hypotriglyceridemic effects in vivo. Whereas thiazolidinediones predominantly affect adipocyte LPL production through activation of PPARgamma, fibrates exert their effects mainly in the liver via activation of PPARalpha. Previous ArticleNext Article Volume 15Issue 191 October 1996In this issue RelatedDetailsLoading ...

Interleukin-6 (IL-6) is a pleiotropic cytokine, whose plasma levels are elevated in inflammatory diseases such as atherosclerosis. We have previously reported that peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) ligands (fibrates) lower elevated plasma concentrations of IL-6 in patients with atherosclerosis and inhibit IL-1-stimulated IL-6 secretion by human aortic smooth muscle cells (SMC). Here, we show that aortic explants isolated from PPARalpha-null mice display an exacerbated response to inflammatory stimuli, such as lipopolysaccharide (LPS), as demonstrated by increased IL-6 secretion. Furthermore, fibrate treatment represses IL-6 mRNA levels in LPS-stimulated aortas of PPARalpha wild-type, but not of PPARalpha-null mice, demonstrating a role for PPARalpha in this fibrate action. In human aortic SMC, fibrates inhibit IL-1-induced IL-6 gene expression. Furthermore, activation of PPARalpha represses both c-Jun- and p65-induced transcription of the human IL-6 promoter. Transcriptional interference between PPARalpha and both c-Jun and p65 occurs reciprocally, since c-Jun and p65 also inhibit PPARalpha-mediated activation of a PPAR response element-driven promoter. This transcriptional interference occurs independent of the promoter context as demonstrated by cotransfection experiments using PPARalpha, p65, and c-Jun Gal4 chimeras. Overexpression of the transcriptional coactivator cAMP-responsive element-binding protein-binding protein (CBP) does not relieve PPARalpha-mediated transcriptional repression of p65 and c-Jun. Finally, glutathione S-transferase pull-down experiments demonstrate that PPARalpha physically interacts with c-Jun, p65, and CBP. Altogether these data indicate that fibrates inhibit the vascular inflammatory response via PPARalpha by interfering with the NF-kappaB and AP-1 transactivation capacity involving direct protein-protein interaction with p65 and c-Jun.

Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) have been implicated in metabolic diseases, such as obesity, diabetes, and atherosclerosis, due to their activity in liver and adipose tissue on genes involved in lipid and glucose homeostasis. Here, we show that the PPARα and PPARγ forms are expressed in differentiated human monocyte-derived macrophages, which participate in inflammation control and atherosclerotic plaque formation. Whereas PPARα is already present in undifferentiated monocytes, PPARγ expression is induced upon differentiation into macrophages. Immunocytochemistry analysis demonstrates that PPARα resides constitutively in the cytoplasm, whereas PPARγ is predominantly nuclear localized. Transient transfection experiments indicate that PPARα and PPARγ are transcriptionally active after ligand stimulation. Ligand activation of PPARγ, but not of PPARα, results in apoptosis induction of unactivated differentiated macrophages as measured by the TUNEL assay and the appearance of the active proteolytic subunits of the cell death protease caspase-3. However, both PPARα and PPARγ ligands induce apoptosis of macrophages activated with tumor necrosis factor α/interferon γ. Finally, PPARγ inhibits the transcriptional activity of the NFκB p65/RelA subunit, suggesting that PPAR activators induce macrophage apoptosis by negatively interfering with the anti-apoptotic NFκB signaling pathway. These data demonstrate a novel function of PPAR in human macrophages with likely consequences in inflammation and atherosclerosis.

Background & AimsElafibranor is an agonist of the peroxisome proliferator−activated receptor-α and peroxisome proliferator−activated receptor-δ. Elafibranor improves insulin sensitivity, glucose homeostasis, and lipid metabolism and reduces inflammation. We assessed the safety and efficacy of elafibranor in an international, randomized, double-blind placebo-controlled trial of patients with nonalcoholic steatohepatitis (NASH).MethodsPatients with NASH without cirrhosis were randomly assigned to groups given elafibranor 80 mg (n = 93), elafibranor 120 mg (n = 91), or placebo (n = 92) each day for 52 weeks at sites in Europe and the United States. Clinical and laboratory evaluations were performed every 2 months during this 1-year period. Liver biopsies were then collected and patients were assessed 3 months later. The primary outcome was resolution of NASH without fibrosis worsening, using protocol-defined and modified definitions. Data from the groups given the different doses of elafibranor were compared with those from the placebo group using step-down logistic regression, adjusting for baseline nonalcoholic fatty liver disease activity score.ResultsIn intention-to-treat analysis, there was no significant difference between the elafibranor and placebo groups in the protocol-defined primary outcome. However, NASH resolved without fibrosis worsening in a higher proportion of patients in the 120-mg elafibranor group vs the placebo group (19% vs 12%; odds ratio = 2.31; 95% confidence interval: 1.02−5.24; P = .045), based on a post-hoc analysis for the modified definition. In post-hoc analyses of patients with nonalcoholic fatty liver disease activity score ≥4 (n = 234), elafibranor 120 mg resolved NASH in larger proportions of patients than placebo based on the protocol definition (20% vs 11%; odds ratio = 3.16; 95% confidence interval: 1.22−8.13; P = .018) and the modified definitions (19% vs 9%; odds ratio = 3.52; 95% confidence interval: 1.32–9.40; P = .013). Patients with NASH resolution after receiving elafibranor 120 mg had reduced liver fibrosis stages compared with those without NASH resolution (mean reduction of 0.65 ± 0.61 in responders for the primary outcome vs an increase of 0.10 ± 0.98 in nonresponders; P < .001). Liver enzymes, lipids, glucose profiles, and markers of systemic inflammation were significantly reduced in the elafibranor 120-mg group vs the placebo group. Elafibranor was well tolerated and did not cause weight gain or cardiac events, but did produce a mild, reversible increase in serum creatinine (effect size vs placebo: increase of 4.31 ± 1.19 μmol/L; P < .001).ConclusionsA post-hoc analysis of data from trial of patients with NASH showed that elafibranor (120 mg/d for 1 year) resolved NASH without fibrosis worsening, based on a modified definition, in the intention-to-treat analysis and in patients with moderate or severe NASH. However, the predefined end point was not met in the intention to treat population. Elafibranor was well tolerated and improved patients’ cardiometabolic risk profile. ClinicalTrials.gov number: NCT01694849. Elafibranor is an agonist of the peroxisome proliferator−activated receptor-α and peroxisome proliferator−activated receptor-δ. Elafibranor improves insulin sensitivity, glucose homeostasis, and lipid metabolism and reduces inflammation. We assessed the safety and efficacy of elafibranor in an international, randomized, double-blind placebo-controlled trial of patients with nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Patients with NASH without cirrhosis were randomly assigned to groups given elafibranor 80 mg (n = 93), elafibranor 120 mg (n = 91), or placebo (n = 92) each day for 52 weeks at sites in Europe and the United States. Clinical and laboratory evaluations were performed every 2 months during this 1-year period. Liver biopsies were then collected and patients were assessed 3 months later. The primary outcome was resolution of NASH without fibrosis worsening, using protocol-defined and modified definitions. Data from the groups given the different doses of elafibranor were compared with those from the placebo group using step-down logistic regression, adjusting for baseline nonalcoholic fatty liver disease activity score. In intention-to-treat analysis, there was no significant difference between the elafibranor and placebo groups in the protocol-defined primary outcome. However, NASH resolved without fibrosis worsening in a higher proportion of patients in the 120-mg elafibranor group vs the placebo group (19% vs 12%; odds ratio = 2.31; 95% confidence interval: 1.02−5.24; P = .045), based on a post-hoc analysis for the modified definition. In post-hoc analyses of patients with nonalcoholic fatty liver disease activity score ≥4 (n = 234), elafibranor 120 mg resolved NASH in larger proportions of patients than placebo based on the protocol definition (20% vs 11%; odds ratio = 3.16; 95% confidence interval: 1.22−8.13; P = .018) and the modified definitions (19% vs 9%; odds ratio = 3.52; 95% confidence interval: 1.32–9.40; P = .013). Patients with NASH resolution after receiving elafibranor 120 mg had reduced liver fibrosis stages compared with those without NASH resolution (mean reduction of 0.65 ± 0.61 in responders for the primary outcome vs an increase of 0.10 ± 0.98 in nonresponders; P < .001). Liver enzymes, lipids, glucose profiles, and markers of systemic inflammation were significantly reduced in the elafibranor 120-mg group vs the placebo group. Elafibranor was well tolerated and did not cause weight gain or cardiac events, but did produce a mild, reversible increase in serum creatinine (effect size vs placebo: increase of 4.31 ± 1.19 μmol/L; P < .001). A post-hoc analysis of data from trial of patients with NASH showed that elafibranor (120 mg/d for 1 year) resolved NASH without fibrosis worsening, based on a modified definition, in the intention-to-treat analysis and in patients with moderate or severe NASH. However, the predefined end point was not met in the intention to treat population. Elafibranor was well tolerated and improved patients’ cardiometabolic risk profile. ClinicalTrials.gov number: NCT01694849.