Abstract Policing occurs in insect, animal and human societies, where it is used as a conditional strategy to prevent cheating and enforce cooperation. Recently, it has been suggested that policing might even be relevant in enforcing cooperation in much simpler organisms such as bacteria. Here, we used individual-based modelling to develop an evolutionary concept for policing in bacteria, and identify the conditions under which it can be adaptive. We modelled interactions between cooperators, producing a beneficial public good, cheaters exploiting the public good without contributing to it, and public good producing policers that secrete a toxin to selectively target cheaters. We found that toxin-mediated policing is favored when (i) toxins are potent and durable, (ii) cheap to produce, (iii) cell and public good diffusion is intermediate, and (iv) toxins diffuse farther than the public good. Overall, we show that toxin-mediated policing can enforce cooperation, but the parameter space where it is beneficial seems quite narrow. Moreover, we found that policing decays when the genetic linkage between public good and toxin production breaks. This is because policing is itself a public good, offering protection to toxin-resistant mutants that still produce public goods, yet no longer invest in toxins. Our work suggests that very specific environmental conditions are required for genetically fixed policing mechanisms to evolve in bacteria, and offers empirically testable predictions for their evolutionary stability.

Abstract Bacterial infections often involve more than one pathogen. While it is known that polymicrobial infections can impact disease outcomes, we have a poor understanding about how pathogens affect each other’s behaviour and fitness. Here, we used a microscopy approach to explore interactions between Pseudomonas aeruginosa and six opportunistic human pathogens that often co-occur in polymicrobial infections: Acinetobacter baumannii , Burkholderia cenocepacia , Escherichia coli , Enterococcus faecium , Klebsiella pneumoniae , and Staphylococcus aureus. When following growing micro-colonies on agarose pads over time, we observed a broad spectrum of species-specific ecological interactions, ranging from mutualism to antagonism. For example, P. aeruginosa engaged in a mutually beneficial interaction with E. faecium but suffered from antagonism by E. coli and K. pneumoniae . While we found little evidence for active directional growth towards or away from cohabitants, we observed that certain species increased growth in double layers in co-cultures and that physical forces due to fast colony expansion had a major impact on fitness and interaction patterns. Overall, our work provides an atlas of pathogen interactions, potentially useful to understand species dynamics in polymicrobial infections. We discuss possible mechanisms driving pathogen interactions and offer predictions of how the different ecological interactions could affect virulence.

Abstract The zebrafish Danio rerio has become a popular model host to explore disease pathology caused by infectious agents. A main advantage is its transparency at an early age, which enables live imaging of infection dynamics. While multispecies infections are common in patients, the zebrafish model is rarely used to study them, although the model would be ideal for investigating pathogen-pathogen and pathogen-host interactions. This may be due to the absence of an established multispecies infection protocol for a defined organ and the lack of suitable image analysis pipelines for automated image processing. To address these issues, we developed a protocol for establishing and tracking single and multispecies bacterial infections in the inner ear structure (otic vesicle) of the zebrafish by imaging. Subsequently, we generated an image analysis pipeline that involved deep learning for the automated segmentation of the otic vesicle, and scripts for quantifying pathogen frequencies through fluorescence intensity measures. We used Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii , and Klebsiella pneumoniae , three of the difficult-to-treat ESKAPE pathogens, to show that our infection protocol and image analysis pipeline work both for single pathogens and pairwise pathogen combinations. Thus, our protocols provide a comprehensive toolbox for studying single and multispecies infections in real-time in zebrafish.

ABSTRACT Sunlight enables virtually all life on earth, but also entails harmful ultraviolet (UV) radiation inducing DNA damage. In response to UV stress, natural selection has favored both curative and preventive measures such as DNA repair mechanisms and UV-absorbing pigments. While UV protection by pigments is well documented in plants, animals and fungi, little is known about their protective role in bacteria. Here, we combine batch-culture and microscopy experiments to show that the siderophore pyoverdine, a fluorescent pigment produced by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa offers high-level protection against UV radiation. Our results reveal that bacteria up-regulate pyoverdine production following UV exposure, seemingly as part of a general stress response. We further found that pyoverdine cannot curatively alleviate UV-damage but protects cells preventively and collectively from oncoming UV exposures through its accumulation in the environment. Altogether, our results reveal a new and non-canonical function of this iron-scavenging molecule, demonstrating that pyoverdine acts as a public sunscreen protecting bacterial populations from UV damage. Given that many bacteria produce pigments, such protection might be widespread in species colonizing habitats exposed to UV radiation.

Organisms as simple as bacteria can engage in complex collective actions, such as group motility and fruiting body formation. Some of these actions involve a division of labor, where phenotypically specialized clonal subpopulations, or genetically distinct lineages cooperate with each other by performing complementary tasks. Here, we combine experimental and computational approaches to investigate potential benefits arising from division of labor during biofilm matrix production. We show that both phenotypic and genetic strategies for a division of labor can promote collective biofilm formation in the soil bacterium Bacillus subtilis. In this species, biofilm matrix consists of two major components; EPS and TasA. We observed that clonal groups of B. subtilis phenotypically segregate into three subpopulations composed of matrix non-producers, EPS-producers, and generalists, which produce both EPS and TasA. This incomplete phenotypic specialization was outperformed by a genetic division of labor, where two mutants, engineered as specialists, complemented each other by exchanging EPS and TasA. The relative fitness of the two mutants displayed a negative frequency dependence both in vitro and on plant roots, with strain frequency reaching a stable equilibrium at 30% TasA-producers, corresponding exactly to the population composition where group productivity is maximized. Using individual-based modelling, we show that asymmetries in strain ratio can arise due to differences in the relative benefits that matrix compounds generate for the collective; and that genetic division of labor can be favored when it breaks metabolic constraints associated with the simultaneous production of two matrix components.

Abstract Heterogeneity in gene expression among cells in clonal groups is common in bacteria. Albeit ubiquitous, it often remains unclear what the sources of variation are and whether variation has functional significance. Here, we tracked the expression of genes involved in the synthesis of iron-chelating siderophores (pyoverdine and pyochelin) in individual cells of the bacterium Pseudomonas aeruginosa during colony growth on surfaces using time-lapse fluorescence microscopy, to explore potential sources and functions of cellular heterogeneity. Regarding sources, we found that the physical position of cells within the colony and epigenetic gene expression inheritance from mother to daughter cells significantly contributed to cellular heterogeneity. In contrast, cell pole age and cellular lifespan had no effect. Regarding functions, our results indicate that cells optimize their siderophore investment strategies (pyoverdine vs. pyochelin) along a gradient from the centre to the edge of the colony. Moreover, we found evidence that cell lineages with above-average siderophore investment increase the fitness of cell lineages with below-average investment through cooperative sharing of secreted siderophores. Altogether, our study highlights that single-cell experiments combined with automated image and cell-tracking analyses can identify sources of heterogeneity and yield adaptive explanations for gene expression variation among clonal bacterial cells.

Abstract Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus frequently occur together in polymicrobial infections, and their interactions can complicate disease progression as well as treatment options. While interactions between P. aeruginosa and S. aureus have been extensively described using planktonic batch cultures, little is known about whether and how individual cells interact with each other on solid substrates. This is important, because in infections, both species frequently colonize surfaces to form microcolony aggregates and biofilms. Here, we performed single-cell time-lapse fluorescence microscopy combined with automated image analysis to describe interactions between P. aeruginosa PAO1 with three different S. aureus strains (Cowan I, 6850, JE2) during microcolony growth on agarose surfaces. While P. aeruginosa is usually considered the dominant species, we found that the competitive balance tips in favor of S. aureus on surfaces. We observed that all S. aureus strains accelerated the onset of microcolony growth in competition with P. aeruginosa and significantly compromised P. aeruginosa growth prior to physical contact. These results suggest that S. aureus deploys mechanisms of both resource competition and interference competition via diffusible compounds. JE2 was the most competitive S. aureus strain, simply usurping P. aeruginosa microcolonies when coming into direct contact, while 6850 was the weakest competitor itself suppressed by P. aeruginosa . Moreover, P. aeruginosa reacted to the assault of S. aureus by showing increased directional growth and expedited expression of quorum sensing regulators controlling the synthesis of competitive traits. Altogether, our results reveal that quantitative single-cell live imaging has the potential to uncover microbial behaviors that cannot be predicted from batch culture studies, and thereby contribute to our understanding of interactions between pathogens that co-colonize host-associated surfaces during polymicrobial infections.

The zebrafish Danio rerio has become a popular model host to explore disease pathology caused by infectious agents. A main advantage is its transparency at an early age, which enables live imaging of infection dynamics. While multispecies infections are common in patients, the zebrafish model is rarely used to study them, although the model would be ideal for investigating pathogen-pathogen and pathogen-host interactions. This may be due to the absence of an established multispecies infection protocol for a defined organ and the lack of suitable image analysis pipelines for automated image processing. To address these issues, we developed a protocol for establishing and tracking single and multispecies bacterial infections in the inner ear structure (otic vesicle) of the zebrafish by imaging. Subsequently, we generated an image analysis pipeline that involved deep learning for the automated segmentation of the otic vesicle, and scripts for quantifying pathogen frequencies through fluorescence intensity measures. We used Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, and Klebsiella pneumoniae, three of the difficult-to-treat ESKAPE pathogens, to show that our infection protocol and image analysis pipeline work both for single pathogens and pairwise pathogen combinations. Thus, our protocols provide a comprehensive toolbox for studying single and multispecies infections in real-time in zebrafish.

How to derive principles of community dynamics and stability is a central question in microbial ecology. To answer this, bottom-up experimental approaches, in which a small number of bacterial species are mixed, have become popular. However, experimental setups are typically limited because species are difficult to distinguish in mixed cultures and co-culture experiments are labor-intensive. Here, we use a community of four bacterial species to show that information from monoculture growth and inhibitory effects caused by secreted compounds can be combined to reliably predict pairwise species interactions in co-cultures. Specifically, integrative parameters from growth curves allow to build a competitive rank order, which is then adjusted using inhibitory compound effects from supernatant assays. While our procedure worked for two media examined, we observed differences in species rank orders between media. We further used computer simulations, parameterized with our empirical data, to show that higher-order species interactions largely follow the dynamics predicted from pairwise interactions with one important exception. The impact of inhibitory compounds was reduced in higher-order communities because these compounds are spread across multiple species, thereby diluting their effects. Altogether, our results lead to the formulation of three simple rules of how monoculture growth and supernatant assay data can be combined to establish competitive species rank orders in bacterial communities.