Ischemic stroke-induced mitochondrial dysfunction in the blood-brain barrier-forming brain endothelial cells (BECs) results in long-term neurological dysfunction post-stroke. We previously reported data from a pilot study where intravenous administration of human BEC (hBEC)-derived mitochondria-containing extracellular vesicles (EVs) showed a potential efficacy signal in a mouse middle cerebral artery occlusion (MCAo) model of stroke. We hypothesized that EVs harvested from donor species homologous to the recipient species (e.g., mouse) may improve therapeutic efficacy, and therefore, use of mouse BEC (mBEC)-derived EVs may improve post-stroke outcomes in MCAo mice. We investigated potential differences in the mitochondria transfer of EVs derived from the same species as the recipient cell (mBEC-EVs and recipient mBECs or hBECs-EVs and recipient hBECs) vs. cross-species EVs and recipient cells (mBEC-EVs and recipient hBECs or vice versa). Our results showed that while both hBEC- and mBEC-EVs transferred EV mitochondria, mBEC-EVs outperformed hBEC-EVs in increasing ATP levels and improved recipient mBEC mitochondrial function via increasing oxygen consumption rates. mBEC-EVs significantly reduced brain infarct volume and neurological deficit scores compared to vehicle-injected MCAo mice. The superior therapeutic efficacy of mBEC-EVs in MCAo mice support the continued use of mBEC-EVs to optimize the therapeutic potential of mitochondria-containing EVs in preclinical mouse models.

Abstract We have demonstrated, for the first time that microvesicles, a sub-type of extracellular vesicles (EVs) derived from hCMEC/D3: a human brain endothelial cell (BEC) line transfer polarized mitochondria to recipient BECs in culture and to neurons in mice acute brain cortical and hippocampal slices. This mitochondrial transfer increased ATP levels by 100 to 200-fold (relative to untreated cells) in the recipient BECs exposed to oxygen-glucose deprivation, an in vitro model of cerebral ischemia. We have also demonstrated that transfer of microvesicles, the larger EV fraction, but not exosomes resulted in increased mitochondrial function in hypoxic endothelial cultures. Gene ontology and pathway enrichment analysis of EVs revealed a very high association to glycolysis-related processes. In comparison to heterotypic macrophage- derived EVs, BEC-derived EVs demonstrated a greater selectivity to transfer mitochondria and increase endothelial cell survival under ischemic conditions. Highlights Microvesicles transfer mitochondria to endothelial cells and brain slice neurons Mitochondrial transfer increased ATP in ischemic brain endothelial cells (BECs) Transfer of microvesicles increased mitochondrial function in hypoxic BECs Transfer of exosomes did not affect mitochondrial function in hypoxic BECs Homotypic BEC-derived EVs result in greater ATP levels in the recipient BECs

Abstract Ischemic stroke causes brain endothelial cell (BEC) death and damages tight junction integrity of the blood-brain barrier (BBB). We harnessed the innate mitochondrial load of endothelial cell-derived extracellular vesicles (EVs) and utilized mixtures of EV/exogenous heat shock protein 27 (HSP27) as a one-two punch strategy to increase BEC survival (via EV mitochondria) and preserve their tight junction integrity (via HSP27 effects). We demonstrated that the medium-to-large (m/lEV) but not small EVs (sEV) transferred their mitochondrial load, which subsequently colocalized with the mitochondrial network of the recipient primary human BECs. BECs treated with m/lEVs increased relative ATP levels and displayed superior mitochondrial function. Importantly, m/lEVs isolated from oligomycin (mitochondrial complex V inhibitor) or rotenone (mitochondrial complex I inhibitor)-exposed BECs (RTN-m/lEVs or OGM-m/lEVs) did not increase BECs ATP levels compared to naïve m/lEVs. In contrast, RTN-sEV and OGM-sEV functionality in increasing cellular ATP levels was minimally impacted in comparison to naïve sEVs. Intravenously administered m/lEVs showed a reduction in brain infarct sizes compared to vehicle-injected mice in a mouse middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke. We formulated binary mixtures of human recombinant HSP27 protein with EVs: EV/HSP27 and ternary mixtures of HSP27 and EV with cationic polymer poly (ethylene glycol)-b-poly (diethyltriamine): (PEG-DET/HSP27)/EV. (PEG-DET/HSP27)/EV and EV/HSP27 mixtures decreased the paracellular permeability of small and large molecular mass fluorescent tracers in oxygen glucose-deprived primary human BECs. This one-two-punch approach to increase BEC metabolic function and tight junction integrity is a promising strategy for BBB protection and prevention of long-term neurological dysfunction post-ischemic stroke. Graphical Abstract Highlights Medium-to-large extracellular vesicles (m/lEVs), not small EVs contain mitochondria m/lEVs increased ATP and mitochondrial function in brain endothelial cells (BECs) m/lEVs from oligomycin-exposed BECs did not increase recipient BEC ATP levels Intravenously injected m/lEVs reduced brain infarct sizes in a mouse stroke model EV/HSP27 mixtures reduced small and large dextran molecule permeability across BECs

Ischemic stroke-induced mitochondrial dysfunction in the blood-brain barrier-forming brain endothelial cells (

Abstract Extracellular vehicles ( EVs ) are an emerging class of drug carriers and are largely known to be internalized into recipient cells via a combination of endocytic routes such as clathrin-mediated, caveolae-mediated and macropinocytosis pathways. In this work, ( 1 ) we investigated potential effects of homotypic vs . heterotypic interactions by studying the cellular uptake of homologous EVs (EV donor cells and recipient cells of the same type) vs . heterologous EVs (EV donor cells and recipient cells of different types) and ( 2 ) determined the route of EV internalization into low pinocytic/hard-to-deliver cell models such as brain endothelial cells ( BECs ). We used BECs and macrophages as low-pinocytic and phagocytic cell models, respectively, to study the effect of homotypic vs . heterotypic interactions on EV uptake in the recipient cells. Homotypic interactions led to a greater extent of uptake into the recipient BECs compared to heterotypic interactions. However, we did not see a complete reduction in EV uptake into recipient BECs when endocytic pathways were blocked using pharmacological inhibitors. Our results suggest that EVs primarily use membrane fusion to enter low-pinocytic recipient BECs instead of relying on endocytosis. Lipophilic PKH67 dye-labeled EVs but not intravesicular esterase-activated calcein ester-labeled EVs severely reduced particle uptake into BECs while phagocytic macrophages internalized both types of EV-labeled particles to comparable extents. Our results also highlight the importance of carefully choosing labeling dye chemistry to study EV uptake, especially in the case of low pinocytic cells such as BECs. Graphical abstract

Abstract Lipidoid nanoparticles (LNPs) are the delivery platform in Onpattro, the first FDA-approved siRNA drug. LNPs are also the carriers in the Pfizer-BioNTech and Moderna COVID-19 mRNA vaccines. While these applications have demonstrated that LNPs effectively deliver nucleic acids to hepatic and muscle cells, it is unclear if LNPs could be used for delivery of siRNA to neural cells, which are notoriously challenging delivery targets. Therefore, the purpose of this study was to determine if LNPs could efficiently deliver siRNA to neurons. Because of their potential utility in either applications in the central nervous system and the peripheral nervous system, we used both cortical neurons and sensory neurons. We prepared siRNA-LNPs using C12-200, a benchmark ionizable cationic lipidoid along with helper lipids. We demonstrated using dynamic light scattering that the inclusion of both siRNA and PEG-lipid provided a stabilizing effect to the LNP particle diameters and polydispersity indices by minimizing aggregation. We found that siRNA-LNPs were safely tolerated by primary dorsal root ganglion neurons. Flow cytometry analysis revealed that Cy5 siRNA delivered via LNPs into rat primary cortical neurons showed uptake levels similar to Lipofectamine RNAiMAX—the gold standard commercial transfection agent. However, LNPs demonstrated a superior safety profile whereas the Lipofectamine-mediated uptake was concomitant with significant toxicity. Fluorescence microscopy demonstrated a time-dependent increase in the uptake of LNP-delivered Cy5 siRNA in a human cortical neuron cell line. Overall, our results suggest that LNPs are a viable platform that can be optimized for delivery of therapeutic siRNAs to neural cells. Graphical Abstract