We report that two classes of membrane nanotubes between human monocyte-derived macrophages can be distinguished by their cytoskeletal structure and their functional properties. Thin membrane nanotubes contained only F-actin, whereas thicker nanotubes, i.e., those > approximately 0.7 microm in diameter, contained both F-actin and microtubules. Bacteria could be trapped and surf along thin, but not thick, membrane nanotubes toward connected macrophage cell bodies. Once at the cell body, bacteria could then be phagocytosed. The movement of bacteria is aided by a constitutive flow of the nanotube surface because streptavidin-coated beads were similarly able to traffic along nanotubes between surface-biotinylated macrophages. Mitochondria and intracellular vesicles, including late endosomes and lysosomes, could be detected within thick, but not thin, membrane nanotubes. Analysis from kymographs demonstrated that vesicles moved in a stepwise, bidirectional manner at approximately 1 microm/s, consistent with their traffic being mediated by the microtubules found only in thick nanotubes. Vesicular traffic in thick nanotubes and surfing of beads along thin nanotubes were both stopped upon the addition of azide, demonstrating that both processes require ATP. However, microtubule destabilizing agents colchicine or nocodazole abrogated vesicular transport but not the flow of the nanotube surface, confirming that distinct cytoskeletal structures of nanotubes give rise to different functional properties. Thus, membrane nanotubes between macrophages are more complex than unvarying ubiquitous membrane tethers and facilitate several means for distal interactions between immune cells.

Abstract We present evidence that nanotubular highways, or membrane nanotubes, facilitate a novel mechanism for intercellular communication in the immune system. Nanotubes were seen to connect multiple cells together and were readily formed between a variety of cell types, including human peripheral blood NK cells, macrophages, and EBV-transformed B cells. Nanotubes could be created upon disassembly of the immunological synapse, as cells move apart. Thus, nanotubular networks could be assembled from transient immunological synapses. Nanotubes were seen to contain GFP-tagged cell surface class I MHC protein expressed in one of the connected cells. Moreover, GPI-conjugated to GFP originating from one cell was transferred onto the surface of another at the connection with a nanotube. Thus, nanotubes can traffic cell surface proteins between immune cells over many tens of microns. Determining whether there are physiological functions for nanotubes is an intriguing new goal for cellular immunology.

Abstract Cell membranes undergo biophysical remodelling as an adaptation to the surroundings and to perform specific biological functions. However, the extent and relevance of such changes in human immune systems remain unknown, largely due to the lack of high throughput and multidimensional methodologies. Here, we describe a cytometry-based method with single-cell resolution which fills this technological gap by combining biophysical profiling with conventional biomarker analysis. This platform allows to reveal notable cell type-dependent remodelling of membrane fluidity during immune stimulations and in diseases. Using immune cells exposed to tumour microenvironment as well as from long COVID and chronic lymphocyte leukaemia patients, we demonstrate that membrane fluidity is orthogonal to surface marker expression. Moreover, this biophysical parameter identifies new functional and pathological states of immune cells previously undetected via surface marker profiling alone. Our findings will contribute to a more precise definition of immune cell states based on their biophysical properties and will pave the way for a better understanding of the functional heterogeneity of immune cells.

Upregulation of diverse self-antigens that constitute components of the inflammatory response overlaps spatially and temporally with the emergence of pathogen-derived foreign antigens. Therefore, discrimination between these inflammation-associated self-antigens and pathogen-derived molecules represents a unique challenge for the adaptive immune system. Here, we demonstrate that CD8

SUMMARY Allogeneic cell therapies hold promise for broad clinical implementation, but face limitations due to potential rejection by the recipient immune system. Silencing of beta-2-microglobulin ( B2M ) expression is commonly employed to evade T cell-mediated rejection, although absence of B2M triggers missing-self responses by recipient natural killer (NK) cells. Here, we demonstrate that deletion of the adhesion ligands CD54 and CD58 on targets cells robustly dampens NK cell reactivity across all sub-populations. Genetic deletion of CD54 and CD58 in B2M -deficient allogeneic chimeric antigen receptor (CAR) T and multi-edited induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived NK cells reduces their susceptibility to rejection by NK cells in vitro and in vivo without affecting their anti-tumor effector potential. Thus, these data suggest that genetic ablation of adhesion ligands effectively alleviates rejection of allogeneic immune cells for immunotherapy.

Abstract Immune synapses are large-scale, transient molecular assemblies that serve as platforms for antigen presentation to B and T cells, and target recognition by cytotoxic T cells and natural killer (NK) cells. The formation of an immune synapse is a tightly regulated, stepwise process where the cytoskeleton, cell-surface receptors and signaling proteins rearrange into supramolecular activation clusters (SMACs). Here we use a reductionist system of microcontact-printed artificial immune synapses (AIS) shaped as hallmark SMAC structures to show that the spatial distribution of activating ligands influences the formation, stability and outcome of NK cell synapses. Organizing ligands into donut-shaped AIS resulted in fewer long-lasting, symmetrical synapses compared to dot-shaped AIS. NK cells spreading evenly over either AIS exhibited similar arrangement of the lytic machinery, however degranulation was only possible in regions allowing local signaling. Our results demonstrate that the macroscopic organization of ligands in the synapse can affect its outcome, which could be exploited by target cells as an escape mechanism.