Abstract Bacterial exonuclease III (ExoIII), widely acknowledged for specifically targeting double-stranded DNA (dsDNA), has been documented as a DNA repair-associated nuclease with apurinic/apyrimidinic (AP)-endonuclease and 3′→5′ exonuclease activities. Due to these enzymatic properties, ExoIII has been broadly applied in molecular biosensors. Here, we demonstrate that ExoIII ( Escherichia coli ) possesses highly active enzymatic activities on ssDNA. By using a range of ssDNA fluorescence-quenching reporters and fluorophore-labeled probes coupled with mass spectrometry analysis, we found ExoIII cleaved the ssDNA at 5′-bond of phosphodiester from 3′ to 5′ end by both exonuclease and endonuclease activities. Additional point mutation analysis identified the critical residues for the ssDNase action of ExoIII and suggested the activity shared the same active center with the dsDNA-targeted activities of ExoIII. Notably, ExoIII could also digest the dsDNA structures containing 3′-end ssDNA. Considering most ExoIII-assisted molecular biosensors require the involvement of single-stranded DNA (ssDNA) or nucleic acid aptamer containing ssDNA, the activity will lead to low efficiency or false positive outcome. Our study revealed the multi-enzymatic activity and the underlying molecular mechanism of ExoIII on ssDNA, illuminating novel insights for understanding its biological roles in DNA repair and the rational design of ExoIII-ssDNA involved diagnostics.

Abstract Remove of mis-incorporated nucleotides ensures replicative fidelity. Although the ε-exonuclease DnaQ is a well-established proofreader in the model organism Escherichia coli , proofreading in mycobacteria relies on the polymerase and histidinol phosphatase (PHP) domain of replicative polymerase despite the presence of an alternative DnaQ homolog. Here, we show that depletion of DnaQ in Mycolicibacterium smegmatis results in increased mutation rate, leading to AT-biased mutagenesis and elevated insertions/deletions in homopolymer tract. We demonstrated that mycobacterial DnaQ binds to the β-clamp and functions synergistically with the PHP domain to correct replication errors. Further, we found that the mycobacterial DnaQ sustains replicative fidelity upon chromosome topological stress. Intriguingly, we showed that a naturally evolved DnaQ variant prevalent in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates enables hypermutability and is associated with extensive drug resistance. These results collectively establish that the alternative DnaQ functions in proofreading, and thus reveal that mycobacteria deploy two proofreaders to maintain replicative fidelity.

Population-scale microbiome study poses specific challenges in data analysis, from enterotype analysis, identification of driver species, to microbiome-wide association of host covariates. Application of advanced data mining techniques to high-dimensional complex dataset is expected to meet the rapid advancement in large scale and integrative microbiome research. Here, we present tmap, a topological data analysis framework for population-scale microbiome study. This framework can capture complex shape of large scale microbiome data into a compressive network representation. We also develop network-based statistical analysis for driver species identification and microbiome-wide association analysis. tmap can be used for exploring variations in a population-scale microbiome landscape to study host-microbiome association.