Abstract The RecA protein and RecBCD complex are key bacterial components for the maintenance and repair of DNA. RecBCD is a helicase-nuclease that uses homologous recombination to resolve double-stranded DNA breaks. It also facilitates coating of single-stranded DNA with RecA to form RecA filaments, a vital step in the double-stranded break DNA repair pathway. However, questions remain about the mechanistic roles of RecA and RecBCD in live cells. Here, we use millisecond super-resolved fluorescence microscopy to pinpoint the spatial localization of fluorescent reporters of RecA or RecB at physiological levels of expression in individual live Escherichia coli cells. By introducing the DNA crosslinker mitomycin C, we induce DNA damage and quantify the resulting steady state changes in stoichiometry, cellular protein copy number and molecular mobilities of RecA and RecB. We find that both proteins accumulate in molecular hotspots to effect repair, resulting in RecA stoichiometries equivalent to several hundred molecules that assemble largely in dimeric subunits before DNA damage, but form periodic subunits of approximately 3-4 molecules within mature filaments of several thousand molecules. Unexpectedly, we find that the physiologically predominant forms of RecB are not only rapidly diffusing monomers, but slowly diffusing dimers.

Abstract As camera pixel arrays have grown larger and faster, and optical microscopy techniques ever more refined, there has been an explosion in the quantity of data acquired during routine light microcopy. At the single-molecule level, analysis involves multiple steps and can rapidly become computationally expensive, in some cases intractable on office workstations. Complex bespoke software can present high activation barriers to entry for new users. Here, we redevelop our quantitative single-molecule analysis routines into an optimized and extensible Python program, with GUI and command-line implementations to facilitate use on local machines and remote clusters, by beginners and advanced users alike. We demonstrate that its performance is on par with previous MATLAB implementations but runs an order of magnitude faster. We tested it against challenge data and demonstrate its performance is comparable to state-of-the-art analysis platforms. We show the code can extract fluorescence intensity values for single reporter dye molecules and, using these, estimate molecular stoichiometries and cellular copy numbers of fluorescently-labeled biomolecules. It can evaluate 2D diffusion coefficients for the characteristically short single-particle tracking data. To facilitate benchmarking we include data simulation routines to compare different analysis programs. Finally, we show that it works with 2-color data and enables colocalization analysis based on overlap integration, to infer interactions between differently labelled biomolecules. By making this freely available we aim to make complex light microscopy single-molecule analysis more democratized. Highlights We present PySTACHIO, a refined version of our spot tracking algorithm We demonstrate highly improved performance over previous MATLAB versions PySTACHIO can accurately estimate stoichiometries and 2D diffusion coefficients Performance is comparable to state-of-the-art packages on challenge data PySTACHIO has both GUI and command line interfaces and can be hosted as a web app Graphical abstract

Abstract The physical and chemical environment inside cells is of fundamental importance to all life but has traditionally been difficult to determine on a subcellular basis. Here we combine cutting-edge genomically integrated FRET biosensing to readout localized molecular crowding in single live yeast cells. Confocal microscopy allows us to build subcellular crowding heatmaps using ratiometric FRET, while whole-cell analysis demonstrates crowding is reduced when yeast is grown in elevated glucose concentrations. Simulations indicate that the cell membrane is largely inaccessible to these sensors and that cytosolic crowding is broadly uniform across each cell over a timescale of seconds. Millisecond single-molecule optical microscopy was used to track molecules and obtain brightness estimates that enabled calculation of crowding sensor copy numbers. The quantification of diffusing molecule trajectories paves the way for correlating subcellular processes and the physicochemical environment of cells under stress.

Abstract Super-resolution microscopy has catalyzed valuable insights into the sub-cellular, mechanistic details of many different biological processes across a wide range of cell types. Fluorescence polarization spectroscopy tools have also enabled important insights into cellular processes through identifying orientational changes of biological molecules typically at an ensemble level. Here, we combine these two biophysical methodologies in a single home-made instrument to enable the simultaneous detection of orthogonal fluorescence polarization signals from single fluorescent protein molecules used as common reporters on the localization of proteins in cellular processes. These enable measurement of spatial location to a super-resolved precision better than the diffraction-limited optical resolution, as well as estimation of molecular stoichiometry based on the brightness of individual fluorophores. In this innovation we have adapted a millisecond timescale microscope used for single-molecule detection to enable splitting of fluorescence polarization emissions into two separate imaging channels for s- and p-polarization signals, which are imaged onto separate halves of the same high sensitivity back-illuminated CMOS camera detector. We applied this fluorescence polarization super-resolved imaging modality to a range of test fluorescent samples relevant to the study of biological processes, including purified monomeric green fluorescent protein, single combed DNA molecules, and protein assemblies and complexes from live Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae cells. Our findings are qualitative but demonstrate promise in showing how fluorescence polarization and super-resolved localization microscopy can be combined on the same sample to enable simultaneous measurements of polarization and stoichiometry of tracked molecular complexes, as well as the translational diffusion coefficient.

Abstract In eukaryotes, intracellular physicochemical properties like macromolecular crowding and cytoplasmic viscoelasticity influence key processes such as metabolic activities, molecular diffusion, and protein folding. However, mapping crowding and viscoelasticity in living cells remains challenging. One approach uses passive rheology in which diffusion of exogenous fluorescent particles internalised in cells is tracked and physicochemical properties inferred from derived mean square displacement relations. Recently, the crGE2.3 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensor was developed to quantify crowding in cells, though it is unclear how this readout depends on viscoelasticity and the molecular weight of the crowder. Here, we present correlative, multidimensional data to explore diffusion and molecular crowding characteristics of molecular crowding agents using super-resolved fluorescence microscopy and ensemble time-resolved spectroscopy. We firstly characterise in vitro and then apply these insights to live cells of budding yeast Saccharomyces cerevisiae . It is to our knowledge the first time this has been attempted. We demonstrate that these are usable both in vitro and in the case of endogenously expressed sensors in live cells. Finally, we present a method to internalise fluorescent beads as in situ viscoelasticity markers in the cytoplasm of live yeast cells, and discuss limitations of this approach including impairment of cellular function.

Abstract Cell division, aging, and stress recovery triggers spatial reorganization of cellular components in the cytoplasm, including membrane bound organelles, with molecular changes in their compositions and structures. However, it is not clear how these events are coordinated and how they integrate with regulation of molecular crowding. We use the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system to study these questions using recent progress in optical fluorescence microscopy and crowding sensing probe technology. We used a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based sensor, illuminated by confocal microscopy for high throughput analyses and Slimfield microscopy for single-molecule resolution, to quantify molecular crowding. We determine crowding in response to cellular growth of both mother and daughter cells, in addition to osmotic stress, and reveal hot spots of crowding across the bud neck in the burgeoning daughter cell. This crowding might be rationalized by the packing of inherited material, like the vacuole, from mother cells. We discuss recent advances in understanding the role of crowding in cellular regulation and key current challenges and conclude by presenting our recent advances in optimizing FRET-based measurements of crowding whilst simultaneously imaging a third color, which can be used as a marker that labels organelle membranes. Our approaches can be combined with synchronised cell populations to increase experimental throughput and correlate molecular crowding information with different stages in the cell cycle.

The double-helical structure of DNA results from canonical base pairing and stacking interactions. However, variations from steady-state conformations result from mechanical perturbations in cells. These different topologies have physiological relevance but their dependence on sequence remains unclear. Here, we use molecular dynamics simulations to show that sequence differences result in markedly different structural motifs upon physiological twisting and stretching. We simulated overextension on four different sequences of DNA ((AA)12, (AT)12, (GG)12 and (GC)12) with supercoiling densities within the physiological range. We found that DNA denatures in the majority of stretching simulations, surprisingly including those with overtwisted DNA. GC-rich sequences were observed to be more stable than AT-rich, with the specific response dependent on base pair ordering. Furthermore, we found that (AT)12 forms stable periodic structures with non-canonical hydrogen bonds in some regions and non-canonical stacking in others, whereas (GC)12 forms a stacking motif of four base pairs independent of supercoiling density. Our results demonstrate that 20-30% DNA extension is sufficient for breaking B-DNA around and significantly above cellular supercoiling, and that the DNA sequence is crucial for understanding structural changes under mechanical stress. Our findings have important implications for the activities of protein machinery interacting with DNA in all cells.

Abstract Biopolymer topology is critical for determining interactions inside cell environments, exemplified by DNA where its response to mechanical perturbation is as important as biochemical properties to its cellular roles. The dynamic structures of chiral biopolymers exhibit complex dependence with extension and torsion, however the physical mechanisms underpinning the emergence of structural motifs upon physiological twisting and stretching are poorly understood due to technological limitations in correlating force, torque and spatial localization information. We present COMBI-Tweez (Combined Optical and Magnetic BIomolecule TWEEZers), a transformative tool that overcomes these challenges by integrating optical trapping, time-resolved electromagnetic tweezers, and fluorescence microscopy, demonstrated on single DNA molecules, that can controllably form and visualise higher order structural motifs including plectonemes. This technology combined with cutting-edge MD simulations provides quantitative insight into complex dynamic structures relevant to DNA cellular processes and can be adapted to study a range of filamentous biopolymers.

Abstract Lipid vesicles are valuable mesoscale molecular confinement vessels for studying membrane mechanics and lipid-protein interactions, and they have found utility among bio-inspired technologies including drug delivery vehicles. While vesicle morphology can be modified by changing the lipid composition and introducing fusion or pore-forming proteins and detergents, the influence of extramembrane crowding on vesicle morphology has remained under explored owing to a lack of experimental tools capable of capturing morphological changes on the nanoscale. Here, we use biocompatible polymers to simulate molecular crowding in vitro , and through combinations of FRET spectroscopy, lifetime analysis, dynamic light scattering and single-vesicle imaging, we characterize how crowding regulates vesicle morphology. We show that both freely-diffusing and surface-tethered vesicles fluorescently tagged with the DiI and DiD FRET pair undergo compaction in response to modest concentrations of sorbitol, polyethylene glycol and Ficoll. A striking observation is that sorbitol results in irreversible compaction, whereas the influence of high molecular weight PEG-based crowders was found to be reversible. Regulation of molecular crowding allows for precise control of vesicle architecture in vitro , with vast implications for drug delivery and vesicle trafficking systems. Furthermore, our observations of vesicle compaction may also serve to act as a mechanosensitive readout of extramembrane crowding.

Abstract The resistance of DNA to stretch, twist and bend is broadly well estimated by experiments and is important for gene regulation and chromosome packing. However, their sequence-dependence and how bulk elastic constants emerge from local fluctuations is less understood. Here, we present SerraNA , which is an open software that calculates elastic parameters of double-stranded nucleic acids from dinucleotide length up to the whole molecule using ensembles from numerical simulations. The program reveals that global bendability emerge from local periodic bending angles in phase with the DNA helicoidal shape. We also apply SerraNA to the whole set of 136 tetra-bp combinations and we observe a high degree of sequence-dependence for all elastic parameters with differences over 200%. Tetramers with TA and CA base-pair steps are especially flexible, while tetramers containing AA and AT tend to be the most rigid. Our results thus suggest AT-rich motifs generate extreme mechanical properties depending of the exact sequence ordering, which seems critical for creating strong global bendability on longer sequences when phased properly. SerraNA is a tool to be applied in the next generation of interdisciplinary investigations to further understand what determines the elasticity of DNA. Graphical TOC Entry