Abstract Intrinsically disordered regions (IDRs) are essential for membrane receptor regulation but often remain unresolved in structural studies. TRPV4, a member of the TRP vanilloid channel family involved in thermo- and osmosensation, has a large N-terminal IDR of approximately 150 amino acids. With an integrated structural biology approach, we analyze the structural ensemble of the TRPV4 IDR and identify a network of regulatory elements that modulate channel activity in a hierarchical lipid-dependent manner through transient long-range interactions. A highly conserved autoinhibitory patch acts as a master regulator by competing with PIP 2 binding to attenuate channel activity. Molecular dynamics simulations show that loss of the interaction between the PIP 2 -binding site and the membrane reduces the force exerted by the IDR on the structured core of TRPV4. This work demonstrates that IDR structural dynamics are coupled to TRPV4 activity and highlights the importance of IDRs for TRP channel function and regulation.

Abstract Plant pathogenic fungi are causative agents of the majority of plant diseases and can lead to severe crop loss in infected populations. Fungal colonization is achieved by combining different strategies, such as avoiding and counteracting the plant immune system and manipulating the host metabolome. Of major importance are effector proteins secreted by the fungi that fulfill diverse functions to support the infection process. Most of these proteins are highly specialized and structural and biochemical information is often absent. Here, we present the atomic structures of the cerato-platanin-like protein Cpl1 from Ustilago maydis and its homolog Uvi2 from Ustilago hordei . Both proteins adopt a double-Ψ-β-barrel architecture reminiscent of cerato-platanin proteins, a class so far not described in smut fungi. Our structure-function analysis shows that Cpl1 binds to soluble chitin fragments via two extended grooves at the dimer interface of the two monomer molecules. This carbohydrate-binding mode has not been observed previously and expands the repertoire of chitin-binding proteins. Cpl1 localizes to the cell wall of U. maydis and specifically enriches cell-wall degrading and -decorating proteins during maize infection. The architecture of Cpl1 harboring four surface exposed loop regions supports the idea that it might play a role in spatial coordination of these proteins. While deletion of cpl1 has only mild effects on the virulence of U. maydis , a recent study showed that deletion of uvi2 strongly impairs U. hordei virulence. Our structural comparison between Cpl1 and Uvi2 reveals sequence variations in the loop regions which might explain a diverging function.

ABSTRACT Prophages need to tightly control their lifestyle to either be maintained within the host genome or enter the lytic cycle. The SPβ prophage present in the genome of Bacillus subtilis 168 was recently shown to possess an arbitrium system defining its replication stage. Using an historic B. subtilis strain harboring the heat-sensitive SPβ c2 mutant, we analyzed a key component of the lysis-lysogeny decision system called YopR, which is critical for maintenance of lysogeny. Here, we demonstrate that the heat-sensitive SPβ c2 phenotype is due to a single nucleotide exchange in the yopR gene, rendering the encoded YopR G136E protein temperature sensitive. Structural characterization of YopR revealed that the protein is a DNA-binding protein with an overall fold like tyrosine recombinases. Biochemical and functional analyses indicate that YopR has lost the recombinase function and the G136E exchange impairs its higher order structure and DNA binding activity. We further show that the heat-inducible SPβ excision of the c2 mutant still depends on the serine recombinase SprA. Finally, an evolution experiment identified the YosL protein of unknown function as a novel component of the lysis-lysogeny management system, as the presence of yosL is crucial for the induction of the lytic cycle of SPβ.

Abstract Members of the phage shock protein A (PspA) family, including the inner membrane-associated protein of 30 kDa (IM30), are suggested to stabilize stressed cellular membranes. Furthermore, IM30 is essential in thylakoid membrane-containing chloroplasts and cyanobacteria, where it is involved in membrane biogenesis and/or remodeling. While it is well known that PspA and IM30 bind to membranes, the mechanism of membrane stabilization is still enigmatic. Here we report that ring-shaped IM30 super-complexes disassemble on membranes, resulting in formation of a membrane-protecting protein carpet. Upon ring dissociation, the C-terminal domain of IM30 unfolds, and the protomers self-assemble on membranes. IM30 assemblies at membranes have been observed before in vivo and were associated to stress response in cyanobacteria and chloroplasts. These assemblies likely correspond to the here identified carpet structures. Our study defines the thus far enigmatic structural basis for the physiological function of IM30 and related proteins, including PspA, and highlights a hitherto unrecognized concept of membrane stabilization by intrinsically disordered proteins.

Abstract The transcriptional antisilencer VirB acts as a master regulator of virulence gene expression in the human pathogen Shigella flexneri . It binds defined sequences ( virS ) upstream of VirB-dependent promoters and counteracts their silencing by the nucleoid-organizing protein H-NS. However, its precise mode of action remains unclear. Notably, VirB is not a classical transcription factor but related to DNA partitioning proteins of the ParB family, which have recently been recognized as DNA-sliding clamps using CTP binding and hydrolysis to control their DNA entry gate. Here, we show that VirB binds CTP, embraces DNA in a clamp-like fashion upon its CTP-dependent loading at virS sites and slides laterally on DNA after clamp closure. Mutations that prevent CTP binding block the loading of VirB clamps in vitro and the formation of VirB nucleoprotein complexes in vivo . Thus, VirB represents a CTP-dependent molecular switch that uses a loading-and-sliding mechanism to control transcription during bacterial pathogenesis.

Two related P-loop ATPases, ParA and MipZ, mediate the spatiotemporal regulation of chromosome segregation and cell division in Caulobacter crescentus. Both of these proteins share the ability to form dynamic concentration gradients that control the positioning of regulatory targets within the cell. Their proper localization relies on their nucleotide-dependent cycling between a monomeric and a dimeric state, driven by interaction with the chromosome partitioning protein ParB, and on the ability of the dimeric species to associate non-specifically with the nucleoid. In this study, we use a combination of genetic screening, biochemical analysis and hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry to identify the residues mediating the interaction of MipZ with DNA. Our results show that the DNA-binding activity of MipZ relies on a series of positively charged and hydrophobic residues lining both sides of the dimer inter-face. MipZ thus appears to associate with DNA in a sequence-independent manner through electrostatic interactions with the DNA phosphate backbone. In support of this hypothesis, chromatin immunoprecipitation analyses did not reveal any specific target sites in vivo. When extending our analysis to ParA, we found that the architectures of the MipZ and ParA DNA-binding sites are markedly different, although their relative positions on the dimer surface and their mode of DNA binding are conserved. Importantly, bioinformatic analysis suggests that the same principles apply to other members of the P-loop ATPase family. ParA-like ATPases thus share common mechanistic features, although their modes of action have diverged considerably during the course of evolution.

The enteric pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium relies on the activity of effector proteins to invade, replicate, and disseminate into host epithelial cells and other tissues, thereby causing disease. Secretion and injection of effector proteins into host cells is mediated by dedicated secretion systems, which hence represent major virulence determinants. Here, we report the identification of a synthetic small molecule with drug-like properties, C26, which suppresses the secretion of effector proteins, and consequently hinders bacterial invasion of eukaryotic cells. C26 binds to and inhibits HilD, the transcriptional regulator of the major secretion systems. While sharing the same binding pocket as the previously described long-chain fatty acid ligands, C26 inhibits HilD with a unique binding mode and a distinct mechanism. We provide evidence for target engagement within infected eukaryotic cells and present analogs with improved potency and suitability as scaffolds to develop anti-virulence agents against Salmonella infections in humans and animals.

Abstract Bactofilins are a widespread family of cytoskeletal proteins with important roles in bacterial morphogenesis, chromosome organization and motility. They polymerize in a nucleotide-independent manner, forming non-polar filaments that are typically associated with the cytoplasmic membrane. Membrane binding was suggested to be mediated by a short N-terminal peptide, but the underlying mechanism and the conservation of this interaction determinant among bacteria remain unclear. Here, we use the bactofilin homolog BacA of the stalked bacterium Caulobacter crescentus as a model to analyze the membrane-binding behavior of bactofilins. Based on site-directed mutagenesis of the N-terminal region, we identify the full membrane-targeting sequence of BacA (MFSKQAKS) and identify amino acid residues that are critical for its function in vivo and in vitro . Molecular dynamics simulations then provide detailed insight into the molecular mechanism underlying the membrane affinity of this peptide. Collectively these analyses reveal a delicate interplay between the water exclusion of hydrophobic N-terminal residues, the arrangement of the peptide within the membrane and the electrostatic attraction between positively charged groups in the peptide and negative charges in the phospholipid molecules. A comprehensive bioinformatic analysis shows that the composition and properties of the membrane-targeting sequence of BacA are conserved in numerous bactofilin homologs from diverse bacterial phyla. Notably, our findings reveal a mutual interdependence between the membrane binding and polymerization activities of BacA. Moreover, we demonstrate that both of these activities have a pivotal role in the recruitment of the BacA client protein PbpC, a membrane-bound cell wall synthase involved in stalk formation whose N-terminal region turns out to associate with the core polymerization domain of BacA. Together, these results unravel the mechanistic underpinnings of membrane binding by bactofilin homologs, thereby illuminating a previously obscure but important aspect in the biology of this cytoskeletal protein family.

Abstract Glycolysis and gluconeogenesis are reciprocal metabolic pathways that utilize different carbon sources. Pyruvate kinase catalyzes the irreversible final step of glycolysis, yet the physiological function of its regulation is poorly understood. Through metabolomics and enzyme kinetics studies, we discovered that pyruvate kinase activity is inhibited during gluconeogenesis in the soil bacterium Bacillus subtilis . This regulation involves an extra C-terminal domain (ECTD) of pyruvate kinase, which is essential for autoinhibition and regulation by metabolic effectors. Introducing a pyruvate kinase mutant lacking the ECTD into B. subtilis resulted in defects specifically under gluconeogenic conditions, including inefficient carbon utilization, slower growth, and decreased resistance to the herbicide glyphosate. These defects are not caused by the phosphoenolpyruvate-pyruvate-oxaloacetate futile cycle. Instead, we identified two significant metabolic consequences of pyruvate kinase dysregulation during gluconeogenesis: increased carbon overflow into the medium and failure to expand glycolytic intermediates such as phosphoenolpyruvate (PEP). In silico analysis revealed that in wild-type cells, an expanded PEP pool enabled by pyruvate kinase regulation is critical for the thermodynamic feasibility of gluconeogenesis. Our findings underscore the importance of allosteric regulation during gluconeogenesis in coordinating metabolic flux, efficient energy utilization, and antimicrobial resistance.

Abstract Inhibition of protein-protein interactions (PPIs) via designed peptides is an effective strategy to interfere with their biological functions. The Elongin BC heterodimer (ELOB/C) is involved in transcription elongation and protein turnover by PPIs that involve the so-called BC-box. ELOB and ELOC are commonly upregulated in cancer and essential for cancer cell growth, making them attractive drug targets. However, no strategy has been established to inhibit their functions in cells, so far. Here, we report a peptide that mimics a high-affinity BC-box and tightly binds to the ELOB/C dimer ( k D = 0.45 ± 0.03 nM). Our peptide blocks the association of ELOB/C with its interaction partners, both in vitro and in the cellular environment. Cancer cells treated with this peptide inhibitor show decreased cell viability, altered cell cycle and increased apoptosis. Therefore, our work proposes that blocking the BC-box binding pocket of ELOB/C is a feasible strategy to impair the function of the ELOB/C heterodimer and inhibit cancer cell growth. Our peptide inhibitor promises novel mechanistic insights into the biological function of the ELOB/C dimer and offers a starting point for therapeutics linked to ELOB/C dysfunction.