Abstract Light can effectively interrogate biological systems in a reversible and physiologically compatible manner with high spatiotemporal precision. Understanding the biophysics of photo-induced processes in bio-systems is crucial for achieving relevant clinical applications. Employing membranes doped with the photolipid azobenzene-phosphatidylcholine (azo-PC), we provide a holistic picture of light-triggered changes in membrane kinetics, morphology and material properties obtained from correlative studies on cell-sized vesicles, Langmuir monolayers, supported lipid bilayers and molecular dynamics simulations. Light-induced membrane area increase as high as ∼25% and a 10-fold decrease in the membrane bending rigidity is observed upon trans -to- cis azo-PC isomerization associated with membrane leaflet coupling and molecular curvature changes. Vesicle electrodeformation measurements and atomic force microscopy reveal that trans azo-PC bilayers are thicker than POPC bilayer but have higher specific membrane capacitance and dielectric constant suggesting an increased ability to store electric charges across the membrane. Lastly, incubating POPC vesicles with azo-PC solutions resulted in the insertion of azo-PC in the membrane enabling them to become photoresponsive. All these results demonstrate that light can be used to finely manipulate the shape, mechanical and electric properties of photolipid-doped minimal cell models and liposomal drug carriers, thus, presenting a promising therapeutic alternative for the repair of cellular disorders.

Abstract Glycosylated RNA (glycoRNA) has recently emerged as a novel constituent of the glycocalyx on cell surfaces, yet its biological functions remain largely unexplored. In this report, we present the first analysis of glycoRNA expression and functionality in alveolar epithelial cells. To this end, we optimized new techniques for the detection of glycoRNA on living cell surfaces and in cell membrane-associated RNA samples through in-gel imaging after labeling with fluorescent dye conjugates. Specifically, we used conjugation of Cy5-hydrazide following mild oxidation with sodium periodate for detection of the entire cell surface sialoglycoRNA pool. Conjugation of dibenzocyclooctyne-sulfo-Cy5 (DBCO-Sulfo-Cy5) in cells fed with tetraacetylated N -azidoacetyl-mannosamine (Ac 4 ManNAz) or 6-azido-L-fucose (FucAz) detected de novo formed sialoglycoRNA or fucoglycoRNA. Finally, biotinylated lectins in combination with infrared dye-conjugated streptavidin was used to differentiate between specific glycosidic linkages. Comparisons across primary alveolar epithelial cells and different alveolar-epithelial like cell lines revealed a cell-type specific variation in glycoRNA abundance. Treatment of primary alveolar epithelial cells with an RNAse cocktail reduced epithelial surface glycoRNA and was associated with a reduction in trans-epithelial electrical resistance and influenza A viral particle abundance. As such, the present work identifies glycoRNA as a novel component of the alveolar epithelial glycocalyx, suggesting its potential relevance in epithelial barrier regulation and viral infection.

ABSTRACT Mucus forms the first defense line of human lungs, and as such hampers the efficient delivery of therapeutics to the underlying epithelium. This holds particularly true for genetic cargo such as CRISPR-based gene editing tools which cannot readily surmount the mucosal barrier. While lipid nanoparticles (LNPs) emerged as versatile non-viral gene delivery systems that could help overcome the delivery challenge, many knowledge gaps remain, especially for diseased states such as cystic fibrosis (CF). This study provides fundamental insights into Cas9 mRNA or ribonucleoprotein-loaded LNP-mucus interactions in healthy and diseased states by assessing the impact of the genetic cargo, mucin sialylation, mucin concentration, ionic strength, pH, and polyethylene glycol (PEG) concentration and nature on LNP diffusivity leveraging experimental approaches and Brownian dynamics simulations. Taken together, this study identifies key mucus and LNP characteristics that are critical to enabling a rational LNP design for transmucosal delivery. Graphical Abstract

ABSTRACT Proper regulation of airway surface liquid (ASL) is essential for effective mucociliary clearance (MCC) in healthy airways, and ASL depletion due to deficient cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-mediated anion/fluid secretion plays an important role in the pathogenesis of mucociliary dysfunction and chronic muco-obstructive lung disease in patients with cystic fibrosis (CF). The current standard for quantitative measurements of ASL height is confocal fluorescence microscopy that has the disadvantage that it requires apical addition of volume for fluorescent staining, and hence perturbation of the ASL. Therefore, our aim was to develop a method that enables studies of ASL regulation under unperturbed conditions using reflected light by confocal microscopy of primary airway epithelial cultures grown at air-liquid interface (ALI). After apical volume addition to primary tracheal mouse cultures, confocal reflection microscopy yielded comparable ASL height as confocal fluorescence microscopy on cultures of wild-type mice, and was sensitive to detect ASL depletion on cultures of βENaC-Tg mice. Under unperturbed conditions, ASL determined by confocal reflection microscopy was significantly higher in wild-type and βENaC-Tg mice compared to values obtained by confocal fluorescence microscopy. Studies in normal and CF primary human airway epithelial cultures showed that confocal reflection microscopy was sensitive to detect effects of low temperature rescue and pharmacological modulation including improvement of CFTR function by VX-809 and VX-770 in cultures from CF patients with the F508del mutation. Our results support confocal reflection microscopy as a novel sensitive technique for quantitative studies of ASL regulation and response to therapeutic intervention under unperturbed near-physiological conditions in healthy and CF airways. NEW & NOTEWORTHY Measurement of airway surface liquid (ASL) height by confocal fluorescence microscopy is an important tool to investigate ASL dysregulation and effects of therapeutic strategies aiming at restoring ASL volume to improve mucociliary clearance and lung function in patients with cystic fibrosis. However, confocal fluorescence microscopy has the disadvantage that it requires apical addition of volume for fluorescent staining of the ASL leading to perturbation of its height and composition. Here, we developed confocal reflection microscopy as a new method that enables quantitative assessment of ASL on highly-differentiated primary airway epithelial cultures under unperturbed near-physiological conditions by detection of refracted light.

The plasma membrane is the interface through which cells interact with their environment. Membrane proteins are embedded in the lipid bilayer of the plasma membrane and their function in this context is often linked to their specific location and dynamics within the membrane. However, few methods are available for nanoscale manipulation of membrane protein location at the single molecule level. Here, we report the use of fluorescent magnetic nanoparticles (FMNPs) to track membrane molecules and to manipulate their movement. FMNPs allow single-particle tracking (SPT) at 10 nm spatial and 5 ms temporal resolution, and using a magnetic needle, we pull membrane components laterally through the membrane with femtonewton-range forces. In this way, we successfully dragged lipid-anchored and transmembrane proteins over the surface of living cells. Doing so, we detected submembrane barriers and in combination with super-resolution microscopy could localize these barriers to the actin cytoskeleton. We present here a versatile approach to probe membrane processes in live cells via the magnetic control of membrane protein motion.