Colorectal cancer (CRC) is a multifaceted disease whose development and progression varies depending on tumor location, age of patients, infiltration of immune cells within cancer lesions, and the tumor microenvironment. These pathophysiological characteristics are additionally influenced by sex-related differences. The gut microbiome plays a pivotal role in the initiation and progression of CRC, and shapes anti-tumor immune responses but how the responsiveness of the immune system to the intestinal microbiota may contribute to the sexual dimorphism of CRC is largely unknown. Here, we studied survival, tumor-infiltrating immune cell populations and tumor-associated microbiome of a cohort of n=184 male and female CRC patients and functionally tested the immune system-microbiome interactions in in vivo and in vitro models of the disease. High-dimensional single-cell flow cytometry showed that female patients are enriched by tumor-infiltrating iNKT cells but depleted by cytotoxic T lymphocytes. The enrichment of oral pathobionts and a reduction of beta-glucuronidase activity are distinctive traits characterizing the gut microbiome of women affected by CRC. Functional assays using a collection of human primary iNKT cell lines demonstrated that the gut microbiota of female patients functionally impairs iNKT cell anti-tumor functions interfering with the granzyme-perforin cytotoxic pathway. These results highlight a sex-dependent functional relationship between the gut microbiome, estrogen metabolism, and the decline of cytotoxic T cell responses, contributing to the sexual dimorphism observed in CRC patients with relevant implications for precision medicine and the design of targeted therapeutic approaches addressing sex bias in cancer.

ABSTRACT Introduction and main objectives Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic, progressive and irreversible interstitial lung disease (ILD), that increases dramatically in incidence and prevalence with age. While successful alveolar regeneration after injury depends on pulmonary capillary endothelial cells (PCEC) reprogramming, the steps involving PCEC during lung injury and resolution as well as the influence of aging are unknown. Methods We used single-cell RNA-seq (scRNA-seq) and spatial transcriptomics to compare the transcriptome of bleomycin-induced fibrotic lungs of young (7 weeks) and aged (18 months) mice, at 3 time points corresponding to the peak of fibrosis (14 days), regeneration (28 days) and resolution (60 days). Results Among the 44541 sequenced and annotated cells, we confirmed the transcriptomic dynamics of several cell types including macrophages, in which conversion is conserved between young and aged mice. We also found that lung injury shifts the transcriptomic profiles of recently described PCEC cell types, with 4 prominent signatures. These signatures are characterized by the overexpression of Lrg1 and are associated with pro-angiogenic signaling, potentially supported by adjacent cell types into the alveolar niche. These signatures were not equally maintained through the resolution process and between young and old animals. Moreover, part of this set of resolution-associated markers was also detected in pulmonary endothelial cells (ECs) from IPF samples. Finally, we found that aging also altered the transcriptome of general capillary cells (gCap) which display typical pro-fibrotic and pro-inflammatory features. Conclusions We provide a detailed characterization of the cellular dynamics associated with fibrosis development and resolution in young and aged lungs and propose that age-associated alterations in specific PCEC subpopulations may interfere with the process of lung progenitor differentiation contributing to the persistent fibrotic process typical of human pathology.

The interaction between the gut microbiota and invariant Natural Killer T (iNKT) cells plays a pivotal role in colorectal cancer (CRC). Porphyromonas gingivalis is a keystone oral pathogen associated with CRC. The oral pathobiont Fusobacterium nucleatum influences the anti-tumour functions of CRC-infiltrating iNKT cells. However, the impact of other oral bacteria, like P. gingivalis, on their activation status remains unexplored. In this study, we demonstrate that mucosa-associated P. gingivalis induces a protumour phenotype in iNKT cells, subsequently influencing the composition of mononuclear-phagocyte cells within the tumour microenvironment in CRC. Mechanistically, in vivo and in vitro experiments show that P. gingivalis reduces the cytotoxic functions of iNKT cells, hampering the iNKT cell lytic machinery though increased expression of chitinase 3-like-1 protein (CHI3L1). Neutralization of CHI3L1 effectively restores iNKT cell cytotoxic functions suggesting a therapeutic potential to reactivate iNKT cell-mediated antitumour immunity. In conclusion, our data demonstrate how P. gingivalis accelerates CRC progression by inducing iNKT cells to upregulate CHI3L1, thus impairing iNKT cell cytotoxicity and promoting host tumour immune evasion.

Abstract Mammary carcinoma, including triple-negative breast carcinomas (TNBC) are tumor-types for which human and canine pathologies are closely related at the molecular level. Low-passage, primary carcinoma cells from TNBC versus non-TNBC were used to compare the efficacy of an oncolytic vaccinia virus (VV). We show that non-TNBC cells are 28 times more sensitive to VV than TNBC cells in which VV replication is impaired. Single-cell RNA-seq performed on two different TNBC cell samples infected or not with VV highlighted three distinct populations: naïve cells, bystander cells, defined as cells exposed to the virus but not infected and infected cells. The transcriptome of these three populations showed striking variations in the modulation of pathways regulated by cytokines and growth factors. We hypothesized that the pool of genes expressed in the bystander populations was enriched in antiviral genes. Bio-informatic analysis suggested that the reduced activity of the virus was associated with a higher mesenchymal status of the cells. In addition, we demonstrate experimentally that high expression of one gene, DDIT4, is detrimental to VV production. Considering that DDIT4 is associated with a poor prognosis in various cancers including TNBC, out data highlight DDIT4 as a candidate resistance marker for oncolytic poxvirus therapy. This information could be used to design new generations of oncolytic poxviruses. Beyond the field of gene therapy, this study demonstrate that single-cell transcriptomics can be used to identify cellular factors influencing viral replication. Author summary The identification of cellular genes influencing viral replication/propagation have been studied using hypothesis-driven approaches and/or high-throughput RNA interference screens. In the present report, we propose a methodology based on single-cell transcriptomic. We have studied, in the context of oncolytic virothepary, the susc eptibility of primary, low-passage mammary carcinoma cells of canine origin from different grades to an oncolytic vaccinia virus (VV). We highlight a fault in replication of VV in cells originated from high-grade triple-negative breast carcinomas (TNBC). Single-cell RNA-seq performed on TNBC cell samples infected with VV suggested that the reduced activity of the virus was associated with a higher mesenchymal status of the cells. We also demonstrate that high expression of one gene, DDIT4, is detrimental to VV production. Considering that DDIT4 is associated with a poor prognosis in various cancers including TNBC, out data highlight DDIT4 as a candidate resistance marker for oncolytic poxvirus therapy. Beyond the field of cancer gene therapy, we demonstrate here that single-cell transcriptomics increases the arsenal of tools available to identify cellular factors influencing viral replication.

Abstract Lineage dedifferentiation towards a mesenchymal-like state is a common mechanism of adaptive response and resistance to targeted therapy in melanoma. Yet, the transcriptional network driving this phenotypic plasticity remains elusive. Remarkably, this cellular state displays myofibroblast and fibrotic features and escapes MAPK inhibitors (MAPKi) through extracellular matrix (ECM) remodeling activities. Here we show that the anti-fibrotic drug Nintedanib/BIBF1120 is active to normalize the fibrous ECM network, enhance the efficacy of MAPK-targeted therapy and delay tumor relapse in a pre-clinical model of melanoma. We also uncovered the molecular networks that regulate the acquisition of this resistant phenotype and its reversion by Nintedanib, pointing the miR-143/-145 pro-fibrotic cluster as a driver of the therapy-resistant mesenchymal-like phenotype. Upregulation of the miR-143/-145 cluster under BRAFi/MAPKi therapy was observed in melanoma cells in vitro and in vivo and was associated with an invasive/undifferentiated profile of resistant cells. The 2 mature miRNAs generated from this cluster, miR-143-3p and miR-145-5p collaborated to mediate phenotypic transition towards a drug resistant undifferentiated mesenchymal-like state by targeting Fascin actin-bundling protein 1 (FSCN1), modulating the dynamic crosstalk between the actin cytoskeleton and the ECM through the regulation of focal adhesion dynamics as well as contributing to a fine-tuning of mechanotransduction pathways. Our study brings insights into a novel miRNA-mediated regulatory network that contributes to non-genetic adaptive drug resistance and provides proof-of-principle that preventing MAPKi-induced pro-fibrotic stromal response is a viable therapeutic opportunity for patients on targeted therapy.