Abstract CUP-SHAPED COTYLEDON1 (CUC1), CUC2, and CUC3 define the boundary domain around organs in the Arabidopsis thaliana meristem. CUC1 and CUC2 transcripts are targeted by a microRNA (miRNA), miR164, encoded by MIR164A, B, and C. We show that each MIR164 is transcribed to generate a large population of primary miRNAs of variable size with a locally conserved secondary structure around the pre-miRNA. We identified mutations in the MIR164A gene that deepen serration of the leaf margin. By contrast, leaves of plants overexpressing miR164 have smooth margins. Enhanced leaf serration was observed following the expression of an miR164-resistant CUC2 but not of an miR164-resistant CUC1. Furthermore, CUC2 inactivation abolished serration in mir164a mutants and the wild type, whereas CUC1 inactivation did not. Thus, CUC2 specifically controls leaf margin development. CUC2 and MIR164A are transcribed in overlapping domains at the margins of young leaf primordia, with transcription gradually restricted to the sinus, where the leaf margins become serrated. We suggest that leaf margin development is controlled by a two-step process in Arabidopsis. The pattern of serration is determined first, independently of CUC2 and miR164. The balance between coexpressed CUC2 and MIR164A then determines the extent of serration.

We have analysed the role of a microRNA, miR164, in boundary formation during organ initiation from Arabidopsis meristems. The establishment and maintenance of the boundary domain are controlled by three partially redundant genes, CUP-SHAPED COTYLEDON1 (CUC1), CUC2 and CUC3. We show that miR164 overexpression phenocopies the cuc1 cuc2 double mutant by inducing post-transcriptional downregulation of CUC1 and CUC2 but not CUC3 mRNA levels. Disruption of CUC2 regulation by miR164, either by making CUC2 resistant to the miRNA or by reducing miRNA levels leads to similar enlarged boundary domains. We relate this enlargement to the division patterns of the boundary cells. We propose that miR164 constrains the expansion of the boundary domain, by degrading CUC1 and CUC2 mRNAs.

Biological shapes are often produced by the iterative generation of repeated units. The mechanistic basis of such iteration is an area of intense investigation. Leaf development in the model plant Arabidopsis is one such example where the repeated generation of leaf margin protrusions, termed serrations, is a key feature of final shape. However, the regulatory logic underlying this process is unclear. Here, we use a combination of developmental genetics and computational modeling to show that serration development is the morphological read-out of a spatially distributed regulatory mechanism, which creates interspersed activity peaks of the growth-promoting hormone auxin and the CUP-SHAPED COTYLEDON2 (CUC2) transcription factor. This mechanism operates at the growing leaf margin via a regulatory module consisting of two feedback loops working in concert. The first loop relates the transport of auxin to its own distribution, via polar membrane localization of the PINFORMED1 (PIN1) efflux transporter. This loop captures the potential of auxin to generate self-organizing patterns in diverse developmental contexts. In the second loop, CUC2 promotes the generation of PIN1-dependent auxin activity maxima while auxin represses CUC2 expression. This CUC2-dependent loop regulates activity of the conserved auxin efflux module in leaf margins to generate stable serration patterns. Conceptualizing leaf margin development via this mechanism also helps to explain how other developmental regulators influence leaf shape.

Diversity in leaf shape is produced by alterations of the margin: for example, deep dissection leads to leaflet formation and less-pronounced incision results in serrations or lobes. By combining gene silencing and mutant analyses in four distantly related eudicot species, we show that reducing the function of NAM / CUC boundary genes ( NO APICAL MERISTEM and CUP-SHAPED COTYLEDON ) leads to a suppression of all marginal outgrowths and to fewer and fused leaflets. We propose that NAM/CUC genes promote formation of a boundary domain that delimits leaflets. This domain has a dual role promoting leaflet separation locally and leaflet formation at distance. In this manner, boundaries of compound leaves resemble boundaries functioning during animal development.

Plant organs are produced from meristems in a characteristic pattern. This pattern, referred to as phyllotaxis, is thought to be generated by local gradients of an information molecule, auxin. Some studies propose a key role for the mechanical properties of the cell walls in the control of organ outgrowth. A major cell-wall component is the linear alpha-1-4-linked D-GalAp pectic polysaccharide homogalacturonan (HG), which plays a key role in cell-to-cell cohesion. HG is deposited in the cell wall in a highly (70%-80%) methyl-esterified form and is subsequently de-methyl-esterified by pectin methyl-esterases (PME, EC 3.1.1.11). PME activity is itself regulated by endogenous PME inhibitor (PMEI) proteins. PME action modulates cell-wall-matrix properties and plays a role in the control of cell growth. Here, we show that the formation of flower primordia in the Arabidopsis shoot apical meristem is accompanied by the de-methyl-esterification of pectic polysaccharides in the cell walls. In addition, experimental perturbation of the methyl-esterification status of pectins within the meristem dramatically alters the phyllotactic pattern. These results demonstrate that regulated de-methyl-esterification of pectins is a key event in the outgrowth of primordia and possibly also in phyllotactic patterning.

Abstract Hydathodes are small organs located on the leaf margins of all vascular plants. They release excess xylem sap through guttation when stomata are closed or when the humidity level is high. Many promoter analyses have suggested other hydathode functions in metabolite transport and auxin metabolism, but experimental demonstration is still lacking. Here, we compared the transcriptomic and metabolomic features of mature Arabidopsis hydathodes to the leaf blade. 1460 differentially-expressed genes were identified revealing that genes related to auxin metabolism, transport, stress, DNA, plant cell wall, RNA or wax were on average more expressed in hydathodes. On the other hand, genes involved in glucosinolate metabolism, sulfation pathway, metal handling or photosynthesis were downregulated in hydathodes. In hydathodes, there are an increased expression of auxin transcriptional regulators and biosynthetic genes, a lower expression of auxin transport genes and a differential expression of genes related to its vacuolar storage that is consistent with increased contents of free and conjugated auxin. We also found that ca. 78% of the total content of 52 xylem sap metabolites were removed from guttation fluid at the hydathode level. Using reverse genetics, we showed that the capture of nitrate and phosphate in the guttation fluid relies on the NRT2.1 and PHT1;4 transporters, respectively. Thus, hydathodes absorb a significant part of xylem sap nutrients, limiting the loss of valuable chemicals during guttation. Our transcriptomic and metabolomic analyses reveal an organ with its own transcriptomic and physiological identity and highlight hydathode biological processes that may impact the whole plant. One sentence summary Transcriptome and physiological analysis of mature and healthy hydathodes of Arabidopsis demonstrates that those organs are sites of intense auxin metabolism and nutrient scavenging

SUMMARY Hydathodes are small organs found on the leaf margins of vascular plants which release excess xylem sap through a process called guttation. While previous studies have hinted at additional functions of hydathode in metabolite transport or auxin metabolism, experimental support is limited. We conducted comprehensive transcriptomic, metabolomic and physiological analyses of mature Arabidopsis hydathodes. This study identified 1460 genes differentially expressed in hydathodes compared to leaf blades, indicating higher expression of most genes associated with auxin metabolism, metabolite transport, stress response, DNA, RNA or microRNA processes, plant cell wall dynamics and wax metabolism. Notably, we observed differential expression of genes encoding auxin‐related transcriptional regulators, biosynthetic processes, transport and vacuolar storage supported by the measured accumulation of free and conjugated auxin in hydathodes. We also showed that 78% of the total content of 52 xylem metabolites was removed from guttation fluid at hydathodes. We demonstrate that NRT2.1 and PHT1;4 transporters capture nitrate and inorganic phosphate in guttation fluid, respectively, thus limiting the loss of nutrients during this process. Our transcriptomic and metabolomic analyses unveil an organ with its specific physiological and biological identity.

How tissue-level information encoded by fields of regulatory gene activity is translated into the patterns of cell polarity and growth that generate the diverse shapes of different species remains poorly understood. Here, we investigate this problem in the case of leaf shape differences between

ABSTRACT Stem cells play important roles in animal and plant biology as they sustain morphogenesis and tissue replenishment following aging or injuries. In plants, stem cells are embedded in multicellular structures called meristems and the formation of new meristems is essential for the plastic expansion of the highly branched shoot and root systems. In particular, axillary meristems that produce lateral shoots arise from the division of boundary domain cells at the leaf base. The CUP-SHAPED COTYLEDON ( CUC ) genes are major determinants of the boundary domain and are required for axillary meristem initiation. However, how axillary meristems get structured and how stem cells become established de novo remains elusive. Here, we show that two NGATHA-LIKE transcription factors, DPA4 and SOD7, redundantly repress CUC expression in the initiating axillary meristem. Ectopic boundary fate leads to abnormal growth and organisation of the axillary meristem and prevents de novo stem cell establishment. Floral meristems of the dpa4 sod7 double mutant show a similar delay in stem cell de novo establishment. Altogether, while boundary fate is required for the initiation of axillary meristems, our work reveals how it is later repressed to allow proper meristem establishment and de novo stem cell niche formation.

Abstract Robustness is pervasive throughout biological systems, enabling them to maintain persistent outputs despite perturbations in their components. Here, we reveal a novel mechanism contributing to leaf morphology robustness in the face of genetic perturbations. In Arabidopsis, leaf shape is established during early development through the quantitative action of the CUP-SHAPED COTYLEDON2 ( CUC2 ) gene that is negatively regulated by the co-expressed MICRORNA164A ( MIR164A ) gene. Compromised epigenetic regulation due to defective Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) function results in the transcriptional derepression of CUC2 but has no impact on CUC2 protein dynamics or early morphogenesis. We solve this apparent paradox by showing that compromised PRC2 function simultaneously activates a compensatory mechanism involving another member of the MIR164 gene family, the MIR164B gene. This mechanism dampens CUC2 protein levels, thereby compensating for compromised PRC2 function and canalizing early leaf morphogenesis. Furthermore, we show that this compensation mechanism is active under different environmental conditions. Our findings shed light on how the interplay between different types of transcriptional regulation can contribute to developmental robustness.